خەۋەرلەر

Nature.com نى زىيارەت قىلغىنىڭىزغا رەھمەت.سىز ئىشلىتىۋاتقان توركۆرگۈچ نۇسخىسىنىڭ CSS قوللىشى چەكلىك.ئەڭ ياخشى تەجرىبە ئۈچۈن يېڭىلانغان تور كۆرگۈچنى ئىشلىتىشىڭىزنى تەۋسىيە قىلىمىز (ياكى Internet Explorer دىكى ماسلىشىشچان ھالەتنى چەكلەڭ).بۇ جەرياندا ، داۋاملىق قوللاشقا كاپالەتلىك قىلىش ئۈچۈن ، تور بېكەتنى ئۇسلۇب ۋە JavaScript ئىشلەتمەيمىز.
راك ھۈجەيرىلىرى ھۈجەيرە بېسىمىنى يېڭىش ۋە ھەر خىل مېخانىزملارنى تەرەققىي قىلدۇردى.ئاقسىل كىنازا R (PKR) ۋە ئۇنىڭ ئاقسىل ئاكتىپلىغۇچىسى (PACT) دەسلەپكى ئىنكاس قايتۇرغۇچىلار بولۇپ ، ھۈجەيرىلەرنىڭ كۆپىيىشى ۋە ئاپتوماتىك داۋالاشنىڭ چەكلىنىشىنى كەلتۈرۈپ چىقىرىدىغان ھەر خىل بېسىم سىگناللىرىنى نازارەت قىلىدۇ.قانداقلا بولمىسۇن ، راك ھۈجەيرىسىدىكى PACT-PKR يولىنى تەڭشەش ئاساسەن نامەلۇم.بۇ يەردە ، ئۇزۇن كودلاشتۇرمىغان RNA (lncRNA) ئاسپارتېل TRNA بىرىكمە ئانتىتېلاغا قارشى تۇرغۇچى RNA 1 (DARS-AS1) نىڭ PACT-PKR يولىنى چەكلەشكە بىۋاسىتە قاتنىشىدىغانلىقىنى ۋە راك ھۈجەيرىسىنىڭ كۆپىيىشىنى ئىلگىرى سۈرىدىغانلىقىنى بايقىدۇق.CRISPRi 971 راكقا مۇناسىۋەتلىك lncRNA نى كەڭ كۆلەمدە تەكشۈرۈش ئارقىلىق ، DARS-AS1 نىڭ راك ھۈجەيرىسىنىڭ كۆپىيىشى بىلەن كۆرۈنەرلىك دەرىجىدە مۇناسىۋەتلىك ئىكەنلىكىنى بايقىدۇق.شۇڭلاشقا ، DARS-AS1 چەكمە ھۈجەيرىسىنىڭ كۆپىيىشىنى تورمۇزلاپ ، ۋىرۇسنىڭ ھەر خىل راك ھۈجەيرىلىرى لىنىيىسىدىكى راك ھۈجەيرىسىنىڭ ئاپتوماتىك ئۆسۈشىنى ئىلگىرى سۈرىدۇ ۋە vivo دىكى ئۆسمىنىڭ ئۆسۈشىنى كۆرۈنەرلىك تۆۋەنلىتىدۇ.مېخانىكىلىق جەھەتتىن ، DARS-AS1 بىۋاسىتە PACT ئاكتىپلاش دائىرىسىگە باغلىنىپ ، PACT-PKR نىڭ ئۆز-ئارا تەسىر كۆرسىتىشىنىڭ ئالدىنى ئالىدۇ ، بۇ ئارقىلىق PKR قوزغىتىش ، eIF2α فوسفورلىنىش ۋە ئاپتوماتىك ھۈجەيرىلەرنىڭ ئۆلۈشىنى چەكلەيدۇ.كلىنىكىدا DARS-AS1 كۆپ خىل راكلاردا كەڭ كۆلەمدە ئىپادىلىنىدۇ ، بۇ lncRNA نىڭ ھەددىدىن زىيادە بېسىم قىلىشى ئالدىن پەرەزنىڭ ياخشى ئەمەسلىكىنى كۆرسىتىپ بېرىدۇ.بۇ تەتقىقات DARS-AS1 lncRNA نىڭ PACT-PKR يولىنى راكقا خاس تەڭشەشنى شەرھلەپ ، راكنى ئالدىن پەرەز قىلىش ۋە داۋالاشنىڭ يەنە بىر نىشانى بىلەن تەمىنلەيدۇ.
بېسىمغا ماسلىشىش ئىقتىدارى راك ھۈجەيرىسىنىڭ ھايات قېلىشى ۋە كۆپىيىشىدىكى مۇھىم ئالاھىدىلىك.راكنىڭ تېز كۆپىيىشى ۋە مېتابولىزىم ئالاھىدىلىكى قاتتىق مىكرو مۇھىتتا ئوزۇقلۇق يېتىشمەسلىك ، قاندىكى ئوكسىدلىنىش ۋە تۆۋەن pH بولۇپ ، ھۈجەيرىلەرنىڭ ئۆلۈشىنى سىگنال بېرىش يولىنى كەلتۈرۈپ چىقىرىدۇ.P535 ، ئىسسىقلىق سوقۇش ئاقسىلى 6 ، 7 ، KRAS8 ، 9 ۋە HIF-110 ، 11 ، 12 ، 13 قاتارلىق بېسىمغا سەزگۈر گېنلارنىڭ قالايمىقانلىشىشى راكتا دائىم كۆرۈلىدۇ ، بۇ ئارقىلىق ئاپپتوز كېسىلىنى توسىدۇ ۋە ھاياتلىقنى ئىلگىرى سۈرىدۇ.
ئاقسىل كىناسى R (PKR) ئېۋكارىئوتىك قوزغىتىش ئامىلى 2α (eIF2α) نىڭ مۇھىم بېسىم سېنزورى ۋە تارماق كىنازا بولۇپ ، ھۈجەيرە بېسىمىنى ھۈجەيرە ئۆلۈمى بىلەن باغلايدىغان تەرجىمە تەڭشىگۈچ.PKR ئەسلىدە چەتئەلنىڭ قوش لىنىيىلىك RNA (dsRNA) نى بايقاش ئارقىلىق ۋىرۇسقا قارشى ئاقسىل ئىكەنلىكى ئېنىقلانغان.قوزغىتىلغاندىن كېيىن ، PKR فوسفوراتى eIF2α ۋىرۇس ۋە ھۈجەيرە ئاقسىلىنىڭ بىرىكىشىنى چەكلەيدۇ 14،15،16.PACT (PKR ئاكتىپلاشتۇرغۇچى ئاقسىل) dsRNA17,18,19,20,21,22,23 بولمىغان ئەھۋال ئاستىدا تۇنجى PKR ئاكتىپلاشتۇرغۇچى ئاقسىل دەپ بېكىتىلدى.PKR بىلەن بىۋاسىتە ئۆز-ئارا تەسىر كۆرسىتىش ئارقىلىق ، PACT ھەر خىل بېسىملارنى (قان زەردابى ئاچارچىلىق ، ئوكسىد ياكى ئارسېننى داۋالاش) PKR ۋە تۆۋەنكى ئېقىندىكى سىگنال يولىنى يەتكۈزدى.EIF2α فوسفورلاشتىن باشقا ، PACT ۋاسىتىچى PKR قوزغىتىش بېسىمغا مۇناسىۋەتلىك ھەر خىل ۋەقەلەرنى قوزغىتىدۇ ، بۇنىڭ ئىچىدە PI3K / Akt24 يولى ئارقىلىق ئۆزگەرتىلگەن قىزىل نۇر ھالىتى ، p5325,26 ئارقىلىق DNA بۇزۇلۇشىنى تەكشۈرۈش كۈچەيتىلدى ، NF-κB27,28 ترانسكرىپسىيەنى تەڭشەيدۇ. ئۇلارنىڭ بېسىمغا تاقابىل تۇرۇش ، كۆپىيىش ، ئاپپتوزوز ۋە باشقا مۇھىم ھۈجەيرە جەريانىدىكى ھالقىلىق رولىنى كۆزدە تۇتقاندا ، PKR ۋە PACT نۇرغۇن كېسەللىكلەرنى ، بولۇپمۇ راكنى 30،31،32،33 داۋالاش نىشانىغا ۋەدە بەردى.قانداقلا بولمىسۇن ، بۇ خىل يېقىشلىق ئىقتىدار ۋە بىئولوگىيىلىك ئەھمىيەتكە ئىگە بولسىمۇ ، راك ھۈجەيرىسىدىكى PACT / PKR پائالىيىتىنى تەڭشەش يەنىلا تەس.
lncRNA بولسا 200 كودتىن چوڭ ئاقسىل بولۇپ ، ئاقسىل كودلاش ئىقتىدارى يوق.ئالدىنقى قاتاردىكى پۈتكۈل گېن تەرتىپلەش تۈرلىرى مىڭلىغان lncRNA لارنى ئېنىقلىغاندىن بۇيان ، ئۇلارنىڭ بىئولوگىيىلىك فۇنكسىيەسىنى ئايدىڭلاشتۇرۇش ئۈچۈن 35،36 كۆپ كۈچ سەرپ قىلىندى.كۈنسېرى كۈچىيىۋاتقان تەتقىقاتلار شۇنى ئىسپاتلىدىكى ، lncRNAs نۇرغۇنلىغان بىئولوگىيىلىك جەريانلارغا قاتناشقان بولۇپ ، X خروموسومىنىڭ ئاكتىپسىزلىنىشىنى تەڭشەش 38،39 ، بېسىش 40 ، ترانسكرىپسىيە 41،42 ، تەرجىمە 43 ، ھەتتا راكنىڭ ئۆسۈشى 44،45،46،47.بۇ تەتقىقاتلار نۇرغۇن lncRNA لارنىڭ PACT / PKR يولىغا قاتناشقانلىقىنى دوكلات قىلدى.بۇ خىل تەتقىقاتلارنىڭ بىرىدە كۆرسىتىلىشىچە ، lncRNA ASPACT PACT تىرانسپورتىنى تورمۇزلاپ ، PACT mRNA نىڭ يادرو ساقلاش ئىقتىدارىنى ئاشۇرغان.باشقا تەتقىقاتلاردا كۆرسىتىلىشىچە ، lncRNA nc886 PKR بىلەن باغلىنىپ ، ئۇنىڭ فوسفورلىنىشنى چەكلەيدۇ.ھازىرغا قەدەر ، PACT ۋاسىتىلىك PKR قوزغىتىشنى تەڭشەيدىغان lncRNA دوكلات قىلىنمىدى.
Aspartyl-tRNA بىرىكمە ئانتىتېلاغا قارشى تۇرغۇچى RNA 1 (DARS-AS1) ئونكېگېنلىق lncRNA51,52,53,54 ئىكەنلىكى ئېنىقلاندى.MiP-194-5p53 ، miP-12952 ۋە miP-532-3p51 نى تەڭشەش ئارقىلىق ، DARS-AS1 ئېنىق ھۈجەيرە بۆرەك راكى ، قالقانسىمان بەز راكى ۋە كىچىك ھۈجەيرە ئۆپكە راكىنىڭ ئۆسۈشىنى ئىلگىرى سۈردى.توڭ ۋە خىزمەتداشلىرى يەنە DARS-AS1 ئاقسىل 39 (RBM39) RNA باغلاش موتىفنىڭ مۇقىملىقىنى ساقلاش ئارقىلىق يىراقنى كۆرەلمەسلىكنىڭ ئىلگىرىلىشىنى ئىلگىرى سۈرىدىغانلىقىنى بايقىدى.قانداقلا بولمىسۇن ، بۇ lncRNA نىڭ PACT-PKR قوزغىتىش ۋە راك ھۈجەيرىلىرىنىڭ بېسىم ئىنكاسىغا چېتىشلىق ياكى ئەمەسلىكى توغرىسىدا ھېچقانداق تەتقىقات ئېلىپ بېرىلمىغان.
بۇ يەردە ، بىز CRISPRi سىستېمىسى ئارقىلىق چوڭ تىپتىكى ئىقتىدار يوقىتىش ئېكرانىنى ئىشلەپ ، DARS-AS1 lncRNA نىڭ بىر نەچچە خىل راك ھۈجەيرىسىنىڭ كۆپىيىشىنى ئىلگىرى سۈرىدىغانلىقىنى ئېنىقلىدۇق.ئۇنىڭدىن باشقا ، بىز بىر ئاساسلىق مېخانىزىمنى بايقىدۇق: DARS-AS1 بىۋاسىتە PACT بىلەن باغلىنىدۇ ، PACT ۋە PKR باغلىنىشىنى چەكلەيدۇ ، تۆۋەن PKR تارماق ئېلېمېنتى eIF2α نىڭ فوسفورلىنىشىنىڭ ئالدىنى ئالىدۇ ۋە ئاخىرىدا ئاپتوماتىك ھۈجەيرىلەرنىڭ ئۆلۈشىنى چەكلەيدۇ.خۇلاسىلىگەندە ، خىزمىتىمىز DARS-AS1 lncRNA نى PACT-PKR يولىنى كونترول قىلغۇچى ۋە راكنى داۋالاش ۋە ئالدىن پەرەز قىلىشتىكى يوشۇرۇن نىشان سۈپىتىدە ئاشكارىلىدى.
كەڭ كۆلەمدە گېن ئارخىپى تەتقىقاتى راك بىلەن مۇناسىۋەتلىك يۈزلىگەن lncRNA نى ئېنىقلاپ چىقتى.قانداقلا بولمىسۇن ، ئۇلارنىڭ ئىقتىدارى ئاساسەن نامەلۇم 56.راكنىڭ تەرەققىي قىلىشىغا قاتنىشىدىغان ئىستىقباللىق lncRNA كاندىداتلىرىنى ئېنىقلاش ئۈچۈن ، بىز CRISPRi سىستېمىسى ئارقىلىق SW620 تۈز ئۈچەي راكى ھۈجەيرىسىدە كۆپىيىشنى ئازايتىش ئۈچۈن ئىقتىدار يوقىتىش ئېكرانىنى قىلدۇق (1a رەسىم).SW480 ۋە SW620 ئۈچەي راكى ھۈجەيرىسىنىڭ ئۆزگىچە ئالاھىدىلىكى شۇكى ، ئۇلار بىر بىماردىكى دەسلەپكى ۋە ئىككىلەمچى ئۆسمىدىن ھاسىل بولغان.بۇ ئىلغار ئۈچەي راكىنىڭ تەرەققىي قىلىشىدىكى گېن ئۆزگىرىشىنى تەتقىق قىلىش ئۈچۈن قىممەتلىك سېلىشتۇرۇش بىلەن تەمىنلەيدۇ.شۇڭلاشقا ، بىز RNA تەرتىپى ئارقىلىق بوغماق ئۈچەي راكى ھۈجەيرىسى (SW480 ۋە SW620) نىڭ خاتىرىسىنى ئانالىز قىلىپ ، ئېلان قىلىنغان ئەدەبىياتتىن بەزى ئىقتىدار خاراكتېرلىك lncRNA لارنى توپلىدۇق.بىز بۇ نەتىجىلەرگە ئاساسەن ، مەنپىي كونترول قىلىش ئۈچۈن 971 راكقا مۇناسىۋەتلىك lncRNAs ۋە 500 نىشانسىز sgRNA oligos نى نىشان قىلغان 7355 sgRNA oligos نى ئۆز ئىچىگە ئالغان بىرلەشتۈرۈلگەن sgRNA كۈتۈپخانىسىنى لايىھەلەپ چىقتۇق (قوشۇمچە سانلىق مەلۇمات 1).
CRISPRi سىستېمىسى ئارقىلىق تەكشۈرۈشنىڭ سىخېمالىق ئىپادىلىنىشى.تەكشۈرۈلگەندىن كېيىن b sgRNA بېيىتىش.گورىزونتال چېكىتلىك سىزىق log2 (قاتلىنىش ئۆزگىرىشى) = ± 0.58 گە ۋەكىللىك قىلىدۇ.تىك چېكىتلىك سىزىق p قىممىتى = 0.05 نى كۆرسىتىدۇ.قارا چېكىت نىشانسىز sgRNA غا ۋەكىللىك قىلىدۇ (NC قىلىپ بېكىتىلگەن).قىزىل چېكىتلەر DARS-AS1 نى نىشان قىلغان sgRNAs.كۆك چېكىتلەر LINC00205 نى نىشان قىلغان sgRNAs ، ئىلگىرى تەسۋىرلەنگەن ئون خىل گېن lncRNA.قاتلىما ئۆزگەرتىش = (نورمال ئوقۇش ، 17-كۈن) / (نورمال ئوقۇش ، 0-كۈن).c DARS-AS1 sgRNA سوقۇلۇش ھۈجەيرىلەرنىڭ ئۆسۈشىنى چەكلىدى.خاتالىق بالدىقى ئۈچ سىناقنىڭ ئۆلچەملىك ئايلىنىشىنى كۆرسىتىدۇ.* p ≤ 0.05 ، ** p ≤ 0.01 ئىككى قۇيرۇقلۇق ئوقۇغۇچىلارنىڭ T سىنىقى.d ئۆسمىدىكى DARS-AS1 ئىپادىسى (TCGA سانلىق مەلۇمات جەدۋىلى).em BLCA ، KIRC ، PRAD ، LUSC ، UCEC ، LUAD ، LIHC ، KIRP ۋە COAD بىمارلىرىنىڭ جۈپلەنگەن نورمال ۋە ئۆسمە ئەۋرىشكىسىدىكى DARS-AS1 نىڭ ئىپادىلىنىشى (TCGA سانلىق مەلۇمات ئامبىرى).p- قىممىتى قوش قۇيرۇقلۇق ئوقۇغۇچىلارنىڭ T سىنىقىدىن پايدىلىنىپ ئېرىشكەن.
پىلازما ياساپ ، لىمون ۋىرۇسىنى ئوراپ بولغاندىن كېيىن ، بىز تۆت مۇستەقىل يۇقۇملىنىش تەجرىبىسىدە dCas9-SW620 بوغماق ئۈچەي راكى ھۈجەيرىسىنى يۇقارقى كۇتۇپخانا بىلەن يۆتكىدۇق.بۇ يۇقۇملىنىشلارنىڭ يۇقۇملىنىش نىسبىتى (MOI) 0.1–0.3 بولۇپ ، ھەر بىر ھۈجەيرىنى پەقەت بىرلا sgRNA ئارقىلىقلا يۆتكىگىلى بولىدىغانلىقىنى كۆرسىتىدۇ.18 كۈنلۈك ۋىرۇس مەدەنىيىتىدىن كېيىن ، نىشانلانغان sgRNAs نىڭ بېيىش ئارخىپى تەكشۈرۈلگەندىن كېيىن تۆۋەنلىدى ياكى كۆپەيدى ، نىشانسىز كونترول قىلىش ئولىگونوكلېئودىدلارنىڭ سانى ئالدىن تەكشۈرۈش ئارخىپىغا سېلىشتۇرغاندا بىر قەدەر ئۆزگەرمىدى ، بۇ بىزنىڭ نىشانىمىزنىڭ ئېكرانغا ئالاھىدە يۇقىرى ئىكەنلىكىنى كۆرسىتىپ بېرىدۇ. كۈتۈپخانا.گۈرۈچ.1b ۋە قوشۇمچە جەدۋەل 1). ئىلگىرى ئۆپكە راكى ۋە جىگەر راكىنىڭ ئىلگىرىلىشىنى ئىلگىرى سۈرىدىغان LINC00205 تەكشۈرۈلگەن (log2 (قاتلاش) <−0.58 ، p قىممىتى <0.05) ، بۇ تەكشۈرۈشنىڭ ئىشەنچلىكلىكىنى ئىسپاتلىدى (1b رەسىم). ئىلگىرى ئۆپكە راكى ۋە جىگەر راكىنىڭ ئىلگىرىلىشىنى ئىلگىرى سۈرىدىغان LINC00205 تەكشۈرۈلگەن (log2 (قاتلاش) <−0.58 ، p قىممىتى <0.05) ، بۇ تەكشۈرۈشنىڭ ئىشەنچلىكلىكىنى ئىسپاتلىدى (1b رەسىم). LINC00205. 1b). LINC00205 ئىلگىرى ئۆپكە راكى ۋە جىگەر راكىنىڭ تەرەققىي قىلىشىنى ئىلگىرى سۈرىدىغانلىقى خەۋەر قىلىنغان 58،59،60 ، چىقىرىۋېتىلدى (log2 (قاتلىنىش ئۆزگىرىشى) <-0.58 ، p قىممىتى <0.05) ، بۇ تەكشۈرۈشنىڭ كۈچلۈكلىكىنى ئىسپاتلىدى (رەسىم .1b) . LINC00205 之前 被 报道 可 促进 肺癌 和 进展 58,59,60 ， 被 筛选 （（log2 （倍数 变化 <-0.58 ， p 值 <0.05） ， 证实 该 筛选 的 b b LINC00205 之前 被 报道 可 促进 肺癌 和 进展 58,59,60 ， 被 筛选 （（log2 （倍数 变化 <-0.58 ， p 值 <0.05） ， 证实 该 筛选 的 b b LINC00205. 1b). LINC00205 ئىلگىرى ئۆپكە ۋە جىگەر راكىنىڭ تەرەققىي قىلىشىنى ئىلگىرى سۈرىدىغانلىقى 58،59،60 ، چىقىرىۋېتىلدى (log2 (قاتلىنىش ئۆزگىرىشى) <-0.58 ، p قىممىتى <0.05) ، بۇ تەكشۈرۈشنىڭ كۈچلۈكلىكىنى ئىسپاتلىدى (رەسىم 1b).
سىناق قىلىنغان بارلىق lncRNA لار ئىچىدە ، DARS-AS1 مۇ تەكشۈرۈلگەن ، ئۈچ خىل بىلىش sgRNA oligonucleotides 18 كۈنلۈك مەدەنىيەتتىن كېيىن كۆرۈنەرلىك تۆۋەنلىگەن ، بۇ lncRNA نىڭ سوقۇلۇشى راكنىڭ كۆپىيىشىنى كەلتۈرۈپ چىقىرىدىغانلىقىنى كۆرسىتىپ بېرىدۇ (1b رەسىم).بۇ نەتىجىنى بوغماق ئۈچەي راكى ھۈجەيرىسىدىكى MTS تەھلىلى تېخىمۇ قوللاپ ، DARS-AS1 سوقۇلۇش ھۈجەيرىسىنىڭ ئېشىش سۈرئىتىنىڭ كونترول ھۈجەيرىسىگە سېلىشتۇرغاندا پەقەت يېرىم ھەسسە ئاشقانلىقىنى ۋە باشقا بىر نەچچە راك تۈرىنىڭ ئىلگىرىكى دوكلاتلىرى بىلەن بىردەك ئىكەنلىكىنى كۆرسەتتى.: ئېنىق ھۈجەيرە بۆرەك راكى ، قالقانسىمان بەز راكى ۋە كىچىك ھۈجەيرە ئۆپكە راكى 51،52،53،55.قانداقلا بولمىسۇن ، ئۇنىڭ تۈز ئۈچەي راكىدىكى رولى ۋە مولېكۇلا مېخانىزىمى تېخىچە تەتقىق قىلىنمىغان.شۇڭلاشقا ، بىز داۋاملىق تەتقىق قىلىش ئۈچۈن بۇ lncRNA نى تاللىدۇق.
بىمارلاردىكى DARS-AS1 ئىپادىسىنى تەتقىق قىلىش ئۈچۈن ، بىز راك گېن گېن ئەتلەس (TCGA) تۈرىدىكى 10 مىڭ 327 ئۆسمە ئەۋرىشكىسىنى ئەتراپلىق تەھلىل قىلدۇق.نەتىجىمىز شۇنى ئىسپاتلىدىكى ، DARS-AS1 چوڭ ئۈچەي تاياقچە باكتېرىيەسى (COAD) ، بۆرەك سۈزۈك ھۈجەيرە راكى (KIRC) ۋە بۆرەك قان تومۇر ئۆسمىسى (KIRP) قاتارلىق ھەر خىل ئۆسمىلەردە ساغلام ھۈجەيرىلەردە كەڭ دائىرىدە ئىپادىلىنىدۇ ۋە كۆرۈنەرلىك تەڭشەلدى..ناھايىتى ئاز (1d رەسىم ۋە قوشۇمچە رەسىم 1a ، b). جۈپ ساغلام / ئۆسمە ئەۋرىشكىسىنى ئانالىز قىلىش دوۋساق سۈيدۈك يولى راكى (BLCA) ، بۆرەك بۆرەك سۈزۈك ھۈجەيرە راكى (KIRC) ، مەزى بېزى كۆكرەك پەردىسى ئۆسمىسى (PRAD) ، ئۆپكە تاياقچە باكتېرىيە راكى (LUSC) ئۆسمىسىدە DARS-AS1 نىڭ كۆرۈنەرلىك يۇقىرى بولىدىغانلىقىنى تېخىمۇ ئىسپاتلىدى. ، بالىياتقۇ ئىچكى پەردىسى بالىياتقۇ ئىچكى پەردىسى راكى (UCEC) ، ئۆپكە قان تومۇر ئۆسمىسى (LUAD) ، جىگەر جىگەر قان تومۇر راكى (LIHC) ، بۆرەك بۆرەك قان تومۇر ئۆسمىسى (KIRP) ۋە چوڭ ئۈچەي تاياقچە باكتېرىيەسى (COAD) (p قىممىتى <0.05) (رەسىم 1e - m). . جۈپ ساغلام / ئۆسمە ئەۋرىشكىسىنى ئانالىز قىلىش دوۋساق سۈيدۈك يولى راكى (BLCA) ، بۆرەك بۆرەك سۈزۈك ھۈجەيرە راكى (KIRC) ، مەزى بېزى كۆكرەك پەردىسى ئۆسمىسى (PRAD) ، ئۆپكە تاياقچە باكتېرىيە راكى (LUSC) ئۆسمىسىدە DARS-AS1 نىڭ كۆرۈنەرلىك يۇقىرى بولىدىغانلىقىنى تېخىمۇ ئىسپاتلىدى. ، بالىياتقۇ ئىچكى پەردىسى بالىياتقۇ ئىچكى پەردىسى راكى (UCEC) ، ئۆپكە قان تومۇر ئۆسمىسى (LUAD) ، جىگەر جىگەر قان تومۇر راكى (LIHC) ، بۆرەك بۆرەك قان تومۇر ئۆسمىسى (KIRP) ۋە چوڭ ئۈچەي تاياقچە باكتېرىيەسى (COAD) (p قىممىتى <0.05) (رەسىم 1e - m). .جۈپ ساغلام / ئۆسمە ئەۋرىشكىسىنى ئانالىز قىلىش ئارقىلىق DARS-AS1 نىڭ دوۋساق سۈيدۈك يولى راكى (BLCA) ، ھۈجەيرە بۆرەك ۋە بۆرەك ھۈجەيرە راكى (KIRC) ، مەزى بېزى كۆكرەك پەردىسى ئۆسمىسى (PRAD) ، ئۆپكە تاياقچە باكتېرىيەسى ئۆسمىسى (LUSC) ئۆسمىسىنىڭ كۆرۈنەرلىك يۇقىرى بولىدىغانلىقىنى ئىسپاتلىدى.، كارتسىنوما энд كانيا ماتا (UCEC) ، ئادېنوكارسىنوما اگوگو (LUAD) ، гепатоц чюларная карцинома пачени (LIHC) ، پاپ ماكارارنو-كلېتوچنايا كارچىنونا پۇكى (KIRP) ۋە adенокарцин ا m). ، بالىياتقۇ ئىچكى پەردىسى راكى (UCEC) ، ئۆپكە ئادېنوكاركېنوما (LUAD) ، جىگەرنىڭ جىگەر راكى (LIHC) ، بۆرەكنىڭ قان تومۇر ئۆسمىسى (KIRP) ۋە چوڭ ئۈچەينىڭ كۆكرەك پەردىسى (COAD). 0.05) (رەسىم 1e– m).AR 健康 / 肿瘤 样本 的 分析 进一步 证实 AR DARS-AS1 在 膀胱 尿路 上皮 B (BLCA) 、 肾 肾 透明 细胞 K (KIRC) EC 着 更高 表达 ， （（（EC EC EC EC EC EC EC EC I I I I I I I I IR IR IR IR IR IR IR <0.05） （图 1e-m）.配对 肿瘤 / 肿瘤 样本 的 分析 ars dars-os1 在 尿路 上 皮 癌 皮 癌 p p p p p p p p p p p p p p p p (lusc) 肿瘤 的 的 的 ih ih lihc） ih癌 （kirp） （coad） （p 值 <0.05） （图 1e-m）.ساغلام / ئۆسمە جۈپ ئەۋرىشكىسىنى ئانالىز قىلىش DARS-AS1 نىڭ دوۋساق سۈيدۈك يولى راكى (BLCA) ، ئېنىق ھۈجەيرە بۆرەك راكى (KIRC) ، مەزى بېزى ئۆسمىسى (PRAD) ۋە ئۆپكە تاياقچە باكتېرىيەسى ئۆسمىسى (LUSC) ئۆسمىسىنىڭ رولىنى تېخىمۇ قوللىدى.ماكان (UCEC) ، аденокарциноме легкого (LUAD) ، гепатоц нюлярной карциноме (LIHC) -m). كورپۇس بالىياتقۇ راكى (UCEC) ، ئۆپكە ئاق قان تومۇر ئۆسمىسى (LUAD) ، جىگەر قان تومۇر راكى (LIHC) ، بۆرەك قان تومۇر ئۆسمىسى (KIRP) ۋە چوڭ ئۈچەي تاياقچە باكتېرىيەسى (COAD) (p قىممىتى <0.05) (1e -m).يىغىپ ئېيتقاندا ، بۇ نەتىجىلەر DARS-AS1 نىڭ ھەر خىل راكلاردا كەڭ ۋە يۇقىرى ئىپادىلەنگەنلىكىنى كۆرسىتىپ بېرىدۇ.
DARS-AS1 ۋە DARS (ۋىرۇسقا قارشى تۇرغۇچى كودنى كودلاشتۇرىدىغان گېن) ئوخشاش تەشۋىق قىلغۇچىنى ئورتاق ئىشلىتىدىغان بولغاچقا ، بىر-بىرىنىڭ يېنىغا جايلاشقان بولغاچقا ، بىز shRNA نى DARS-AS1 نى مەخسۇس قۇلۇپلاش ئۈچۈن لايىھىلەپ چىقتۇق ، ئەمما DARS ئەمەس (قوشۇمچە 2a رەسىم ، b ۋە قوشۇمچە 2-جەدۋەل) .SW620 دىن باشقا ، بىز يەنە DARS-AS1 نى ئىپادىلەيدىغان باشقا ئۈچ ھۈجەيرە لىنىيىسىنى ئىشلىتىپ ، shRNA سوقۇلۇشنىڭ ئۈنۈمى ۋە ئىقتىدارىنى تەتقىق قىلدۇق (قوشۇمچە 3-جەدۋەل).نەتىجىمىز شۇنى ئىسپاتلىدىكى ، تەرەققىي قىلغان ئۈچ shRNA نىڭ ھەممىسى ئاز دېگەندە% 80 DARS-AS1 سوقۇلۇش ئۈنۈمىنى قولغا كەلتۈرگەن بولۇپ ، DARS mRNA نىڭ مىقدارىغا ئازراق تەسىر كۆرسىتەلمەيدۇ (قوشۇمچە رەسىم 2c - f).بۇنىڭدىن باشقا ، بىز بۇ SHRNA لار بىلەن DARS-AS1 سوقۇلۇشنىڭ تۈز ئۈچەي راكى ھۈجەيرىسىنىڭ SW620 (% 49.7) ۋە HCT116 (% 27.7) ، سۈت بېزى راكى ھۈجەيرىسىنىڭ MBA-MD-231 (% 53.4) نىڭ ئۆسۈشىنى كۆرۈنەرلىك چەكلىگەنلىكىنى بايقىدۇق.) ۋە HepG2 تىپلىق جىگەر ھۈجەيرىسى لىنىيىسى (% 92.7 تۆۋەنلەش) ، شۇنداقلا ئۇلارنىڭ ماسلاشمىغان دائىرىنى شەكىللەندۈرۈش ئىقتىدارى (ھەر بىر ھۈجەيرە لىنىيىسىنىڭ ئوتتۇرىچە تۆۋەنلەش نىسبىتى% 50.8 ،% 44.6 ،% 40.7 ۋە% 75.7) (2a رەسىم ، b).SW620 دە ، مۇستەملىكە شەكىللەندۈرۈش نەتىجىسىنىڭ نەتىجىسى DARS-AS1 shRNA نىڭ ھۈجەيرىلەرنىڭ كۆپىيىشىنى كۆرۈنەرلىك چەكلەپ ، ئوتتۇرىچە% 69.6 تۆۋەنلىگەنلىكىنى ئىسپاتلىدى (2c رەسىم).
كونترول قىلىش shRNA ۋە DARS-AS1 shRNA نىڭ SW620 ، HCT116 ، MBA-MD-231 ۋە HepG2 ھۈجەيرىسىدىكى ھۈجەيرىلەرنىڭ كۆپىيىشى (a) ۋە ئىسپېرما شەكىللىنىشىگە بولغان تەسىرى.c كونترول قىلىش shRNA ۋە DARS-AS1 shRNA نىڭ SW620 ھۈجەيرىسىدىكى مۇستەملىكە شەكىللىنىشىگە بولغان تەسىرى.ھۈجەيرىلەرنىڭ كۆپىيىشى (d) ، سپروئىدنىڭ شەكىللىنىشى (e) ۋە SW620 ھۈجەيرىسىنىڭ مۇستەملىكىسىنىڭ شەكىللىنىشى (f) DARS-AS1 نى ھەددىدىن زىيادە بېسىم قىلىدۇ.كۆرسىتىلگەن سانلىق مەلۇماتلار ئۈچ خىل سىناقنىڭ ئوتتۇرىچە ± ئۆلچەملىك ئايلىنىشى.* p ≤ 0.05 ، ** p ≤ 0.01 ، ۋە *** p ≤ 0.001 ئىككى قۇيرۇقلۇق ئوقۇغۇچىلارنىڭ T سىنىقى.
ئىقتىدار يوقىتىش تەتقىقاتىنى تولۇقلاش ئۈچۈن ، بىز كېيىنكى قەدەمدە SW620 ھۈجەيرىسىنى ھەددىدىن زىيادە بېسىم قىلىدىغان DARS-AS1 نى قۇردۇق (قوشۇمچە رەسىم 2g).DARS-AS1 ھەددىدىن زىيادە بېسىم قىلىش SW620 ھۈجەيرىسىدە ھۈجەيرىلەرنىڭ ئۆسۈشىنى (1.8 ھەسسە) ، ماسلاشمىغان سپېروئىدنىڭ شەكىللىنىشىنى (1.4 ھەسسە) ۋە مۇستەملىكە شەكىللىنىشىنى (3.3 ھەسسە) كۆرۈنەرلىك ئاشۇردى (رەسىم 2d - f).بىز بۇ نەتىجىنى A549 ئىپادىلەيدىغان يەنە بىر DARS-AS1 ئارقىلىق دەلىللىدۇق.DARS-AS1 ھەددىدىن زىيادە بېسىم سەۋەبىدىن بۇ كۈچەيتىلگەن ھۈجەيرىلەرنىڭ كۆپىيىشى A549 ھۈجەيرىسىدە تېخىمۇ كۆرۈنەرلىك بولدى (قوشۇمچە 2h ، i ۋە قوشۇمچە جەدۋەل 3).ئومۇملاشتۇرغاندا ، بۇ پايدا ۋە زىيان تەتقىقاتى DARS-AS1 نىڭ ۋىرۇستا راك ھۈجەيرىسىنىڭ كۆپىيىشىنى ئىلگىرى سۈرىدىغانلىقىنى كۆرسىتىپ بېرىدۇ.
DARS-AS1 ھۈجەيرىلەرنىڭ كۆپىيىشىنى تەڭشەيدىغان ئاساسىي مېخانىزم ئۈستىدە ئىزدىنىش ئۈچۈن ، بىز RNA تارتما ئانالىز ئېلىپ بېرىپ ، ئۇنىڭ ئاقسىلنى باغلاشتىكى شېرىكلىرىنى ئېنىقلىدۇق.RT-qPCR نەتىجىسىدە كۆرسىتىلىشىچە ، DARS-AS1 نىڭ تەخمىنەن% 86.2 ى SW620 ھۈجەيرىسىنىڭ سىپوپلازمىسىغا جايلاشقان (قوشۇمچە 3a رەسىم).ۋىرۇستا كۆچۈرۈلگەن بىئوتىن بىرىكتۈرۈلگەن DARS-AS1 ياكى ساختا RNA ئاندىن SW620 ھۈجەيرە لىماتسىيىسى بىلەن سىڭدۈرۈلۈپ ، SDS-PAGE ئايرىلدى.كېيىنكى كۈمۈش داغدا كۆرسىتىلىشىچە ، DARS-AS1 تارتىش ئەۋرىشكىسىدە ئالاھىدە بەلۋاغ (~ 38 kDa) كۆرۈنەرلىك بېيىغان ، ئەمما تۇتۇق RNA ياكى مونچاق ئەۋرىشكىسىدە ئەمەس (3a رەسىم).بۇ گۇرۇپپا ئاممىۋى سپېكترومېتىرىيە (MS) تەرىپىدىن PKR ئاكتىپلاش ئاقسىلى (PACT) دەپ ئېنىقلانغان ۋە SW620 ، HCT116 ۋە HepG2 ھۈجەيرە لىنىيىسىدىكى ئىممۇنىتېت يوقىتىش ئارقىلىق تېخىمۇ جەزملەشتۈرۈلگەن (3a رەسىم ، b).DARS ۋە مۇناسىۋەتلىك PACT ئاقسىلى - PKR ۋە TRBP نىڭ موللىنىشى غەربنىڭ blotting (WB) تەرىپىدىن RNA ئانالىزى ئارقىلىق تەكشۈرۈلگەن.نەتىجىدە DARS-AS1 RNA بىلەن بۇ ئۈچ خىل ئاقسىل ئوتتۇرىسىدا بىۋاسىتە ئۆز-ئارا تەسىر بايقالمىغانلىقى كۆرسىتىلدى (قوشۇمچە 3b رەسىم).DARS-AS1 بىلەن PACT ئوتتۇرىسىدىكى كونكرېت ئۆز-ئارا تەسىر RNA ئىممۇنىتېت كۈچىنىڭ تۆۋەنلىشى (RIP) تەھلىلى ئارقىلىق تېخىمۇ ئىسپاتلاندى ، بۇ DARS-AS1 نىڭ PACT غا قارشى ئانتىتېلادا كۆرۈنەرلىك بېيىغانلىقىنى ، ئەمما باشقا كونترول RNA ئەمەسلىكىنى كۆرسەتتى (3c رەسىم).باشقا ھۈجەيرە زاپچاسلىرى بولمىغان ئەھۋالدا DARS-AS1 نىڭ PACT بىلەن بىۋاسىتە ئۆز-ئارا تەسىر كۆرسىتىدىغان ياكى ئۇچرىمايدىغانلىقىنى ئېنىقلاش ئۈچۈن ، ساپلاشتۇرۇلغان PACT ئارقىلىق ۋىرۇسلۇق بىئولوگىيىلىك ئارىلاشما ئارىلىق (BLI) تەكشۈرۈشى ئېلىپ بېرىلدى.بىئوتىن بەلگىسى قويۇلغان DARS-AS1 ياكى تۇتۇق RNA streptavidin (SA) بىئولوگىيىلىك سېنزوردا ھەرىكەتلەندۈرۈلۈپ ، ئاندىن 1 μM PACT بولغان ھەرىكەتچان بۇففېرغا سىڭدۈرۈلگەن.دىققەت قىلىشقا ئەرزىيدىغىنى ، PACT DARS-AS1 (KD قىممىتى ~ 26.9 nM) بىلەن كۈچلۈك باغلانغان ، ئەمما RNA غا تەقلىد قىلىنمىغان (3d رەسىم).يىغىپ ئېيتقاندا ، بۇ نەتىجىلەر DARS-AS1 بىلەن PACT ئوتتۇرىسىدىكى بىۋاسىتە ئۆز-ئارا تەسىر ۋە يۇقىرى يېقىنلىقنى كۆرسىتىپ بېرىدۇ.
RNA تارتىش ئانالىزى DARS-AS1 نىڭ SW620 ھۈجەيرىسىدىكى PACT بىلەن ئۆز-ئارا تەسىر كۆرسىتىدىغانلىقىنى ئېنىقلاپ چىقتى.ئۈستىدە ، مۇناسىۋەتلىك ئاقسىللارنىڭ كۈمۈش داغلىرى.تۆۋەن ئىممۇنىتېت كۈچى PACT ئانتىتېلاسى بىلەن ئېلىپ بېرىلدى.b RNA تارتىپ چىقىرىش ئانالىزى HCT116 (ئۈستى) ۋە HepG2 (ئاستى) ھۈجەيرىلەردە ئېلىپ بېرىلدى.ئىممۇنىتېت يوقىتىش ئارقىلىق PACT نىڭ موللىنىشى بايقالدى.cRNA ئىممۇنىتېت كۈچى (RIP) تەكشۈرۈشى SW620 ھۈجەيرىسىدە كۆرسىتىلگەن ئانتىتېلادىن پايدىلىنىپ ئېلىپ بېرىلدى.d PACT باغلاش ئەگرى سىزىقى پۈتۈن ئۇزۇنلۇقتىكى DARS-AS1 ياكى كونترول RNA غا بىئولوگىيىلىك ئارىلاشما ئارىلىق (BLI) ئارقىلىق ئېرىشىلگەن.RNA سترېپتاۋىدىن بىئولوگىيىلىك سېنزوردا ھەرىكەتلەندۈرۈلدى.ئۇيۇشمىنى ئۆلچەشتە 1 μM PACT ئىشلىتىلگەن.e RNA تارتىش ئەسۋابى بىئوتىنلانغان تولۇق ئۇزۇنلۇقتىكى DARS-AS1 ياكى كېسىلگەن (ئۈستى) ئارقىلىق ئېلىپ بېرىلدى.PACT نى تاپشۇرۇۋالغان Immunoblot (ئاستى).f ساپلاشتۇرۇلغان بايراقلىق PACT بىئوتىن بىرىكتۈرۈلگەن تولۇق ئۇزۇنلۇقتىكى DARS-AS1 بىلەن سىڭدۈرۈلگەن ياكى ۋىرۇس RIP تەكشۈرۈشىدە كېسىلگەن (e دىكىگە ئوخشاش).ئېلىنغان RNA RT-qPCR تەرىپىدىن تەكشۈرۈلگەن.g PACT ئۈچۈن ئوخشىمىغان RNA پارچىلىرىنىڭ نىسپىي يېقىنلىقى بىئولوگىيىلىك ئارىلىق ئارىلىقى ئارقىلىق قولغا كەلگەن.تەھلىل قىلىش ئۈچۈن ، 100 nM RNA ۋە 1 μM RAST ئىشلىتىلگەن.h In vitro RIP تەكشۈرۈشى ساپلاشتۇرۇلغان مۇكەممەل ياكى قىسقارتىلغان PACT بەلگىسى ئارقىلىق ئېلىپ بېرىلدى.ئېلىنغان RNA RT-qPCR تەرىپىدىن تەكشۈرۈلگەن.i SW620 ھۈجەيرىسىنىڭ ئېشىش سۈرئىتى DARS-AS1 ، PACT ياكى ھەر ئىككىسىنى ھەددىدىن زىيادە بېسىم قىلىدۇ.j SW620 ھۈجەيرىسىدىكى پۈتۈن ئۇزۇنلۇق ياكى قىسقارتىلغان DARS-AS1 نىڭ ھەددىدىن زىيادە بېسىم قىلىشى ھۈجەيرىلەرنىڭ ئۆسۈشىگە ئوخشىمىغان تەسىرلەرنى كۆرسەتتى.k ئاپپتوزوز PARP غا قارشى ئانتىتېلا بىلەن ئىممۇنىتېت يوقىتىش ئارقىلىق بايقالغان.l DARS-AS1 نىڭ Knockout ئېقىمى سىتومېتىرىيىسىدە كۆرسىتىلگەندەك SW620 ھۈجەيرىسىنىڭ ئاپپتوز كېسىلىنى كەلتۈرۈپ چىقىرىدۇ.كۆرسىتىلگەن سانلىق مەلۇماتلار ئۈچ خىل سىناقنىڭ ئوتتۇرىچە ± ئۆلچەملىك ئايلىنىشى. * p ≤ 0.05 ، ** p ≤ 0.01 ، *** p ≤ 0.001 ، **** p <0.0001 ، ئىككى قۇيرۇقلۇق ئوقۇغۇچىلارنىڭ T سىنىقى ئارقىلىق. * p ≤ 0.05 ، ** p ≤ 0.01 ، *** p ≤ 0.001 ، **** p <0.0001 ، ئىككى قۇيرۇقلۇق ئوقۇغۇچىلارنىڭ T سىنىقى ئارقىلىق. * p ≤ 0,05, ** p ≤ 0,01, *** p ≤ 0,001, **** p <0,0001 по дву зононнему критерию Стьюдента. * p ≤ 0.05 ، ** p ≤ 0.01 ، *** p ≤ 0.001 ، **** p <0.0001 ئىككى قۇيرۇقلۇق ئوقۇغۇچىلارنىڭ T سىنىقى. * p ≤ 0.05, ** p ≤ 0.01, *** p ≤ 0.001, **** p <0.0001 ， 通过 双 尾 学生 t 检验。 * p ≤ 0.05, ** p ≤ 0.01, *** p ≤ 0.001, **** p <0.0001 ， 通过 双 尾 学生 t 检验。 * p ≤ 0,05, ** p ≤ 0,01, *** p ≤ 0,001, **** p <0,0001 по дву зононнему критерию Стьюдента. * p ≤ 0.05 ، ** p ≤ 0.01 ، *** p ≤ 0.001 ، **** p <0.0001 ئىككى قۇيرۇقلۇق ئوقۇغۇچىلارنىڭ T سىنىقى.
ئاندىن بىز PACT بىرلەشمىسى ئۈچۈن تەلەپ قىلىنغان DARS-AS1 رايونىنى ئېنىقلاش ئۈچۈن ۋىرۇس كۆچۈرۈش ئارقىلىق ئۈچ خىل بىئوتىن بىرىكتۈرۈلگەن DARS-AS1 RNA پارچىسىنى ھاسىل قىلدۇق (3e رەسىم).RNA ئانالىز نەتىجىسى شۇنى ئىسپاتلىدىكى ، ھەر بىر بۆلەك PACT بىلەن ئۆز-ئارا تەسىر كۆرسىتەلەيتتى ، ئەمما 3 ′ تېرمىنال رايونى (A3 دەپ يېزىلغان 384-768 يادرو) A1 دەپ يېزىلغان 1 ~ 384 دىن ئارتۇق يادرونى كۆرسەتتى) (3e رەسىم).مۇشۇنىڭغا ئوخشاش نەتىجىلەر قايتا ھاسىل بولىدىغان PACT ئارقىلىق ۋىرۇسلۇق RIP تەكشۈرۈشىدە كۆرۈلگەن (3f رەسىم).بۇ نەتىجىلەرگە ماس ھالدا ، BLI ئارقىلىق ھەرىكەتلەندۈرۈلگەن RNA پارچىلىرىنى PACT بىلەن باغلاش تەجرىبىسى يەنە PACT نىڭ A3 (384–768 nt) (KD قىممىتى تەخمىنەن 94.6 nM) غا بولغان يېقىنلىقى بارلىقىنى كۆرسىتىپ بەردى ، ئەمما باشقا رايونلار بىلەن ئالاقىسى يوق دېيەرلىك.(3-رەسىم).
بىز يەنە PACT دىكى باغلىنىشلىق رايونلارنى تەكشۈردۇق.PACT ئۈچ خىل ئىقتىدار دائىرىسىنى ئۆز ئىچىگە ئالىدۇ ، بۇنىڭ ئىچىدە ئىككىسى قوش لىنىيىلىك RNA باغلاش دائىرىسى (dsRBD) ۋە ئۈچىنچىسى (بېكىتىلگەن D3) ئاقسىل ئۆز-ئارا تەسىر قوزغىغۇچى رولىنى ئوينايدۇ.ھەر بىر ساھەنىڭ lncRNA باغلاش ئىقتىدارىنى تەكشۈرۈش ئۈچۈن ، بىز ئۈچ ساھەنىڭ ھەر بىرىنى چىقىرىپ تاشلاپ ، ۋىرۇسلۇق RIP تەكشۈرۈش ئېلىپ باردۇق.نەتىجىمىز شۇنى ئىسپاتلىدىكى ، PACT نىڭ ئۈچىنچى دائىرە (D3) ئۆچۈرۈلۈشى باشقا ئىككى ئۆزگىرىشكە سېلىشتۇرغاندا DARS-AS1 (مۇكەممەل PACT بىلەن سېلىشتۇرغاندا 0.11 ھەسسە) ئۆز-ئارا تەسىرنى كۆرۈنەرلىك تۆۋەنلەتتى (3h رەسىم) ، ئېلان قىلىنغانلىقى كۆرسىتىلدى. D3 نىڭ DARS بىلەن ئۆز-ئارا تەسىر كۆرسەتكەن.-AC1.ئومۇملاشتۇرغاندا ، بۇ نەتىجىلەر DARS-AS1 بىلەن PACT ئوتتۇرىسىدىكى ئۆز-ئارا تەسىرنىڭ ئاساسلىقى DARS-AS1 نىڭ 3 ′ ئاخىرى ۋە PACT نىڭ D3 دائىرىسى ئارقىلىق يۈز بېرىدىغانلىقىنى كۆرسىتىپ بېرىدۇ.
بىز DARS-AS1 نىڭ PACT ئىپادىسىگە ھېچقانداق تەسىر كۆرسەتمىگەنلىكىنى ، PACT نىڭ DARS-AS1 غا ھېچقانداق تەسىر كۆرسەتمىگەنلىكىنى ئەسكەرتتۇق (قوشۇمچە 3-رەسىم).ئاندىن PACT سوقۇلۇشنىڭ ھۈجەيرىلەرنىڭ ئۆسۈشىگە بولغان تەسىرىنى تەكشۈردۇق.DARS-AS1 بىلەن سېلىشتۇرغاندا ، PACT سوقۇلغاندا نىسپىي ھۈجەيرىلەر 1.5-3 ھەسسە تېز ئاشتى (قوشۇمچە 3d رەسىم).مۇستەملىكە شەكىللەندۈرۈش نەتىجىسىنىڭ كۆرسىتىشىچە ، ھۈجەيرىلەر PACT ئارقىلىق shRNA نى داۋالىغاندىن كېيىن 2-3 ھەسسە مۇستەملىكە ھاسىل قىلغان (قوشۇمچە 3-رەسىم).DARS-AS1 نىڭ PACT ئارقىلىق ھۈجەيرىلەرنىڭ كۆپىيىشىنى تەڭشەيدىغانلىقىنى سىناق قىلىش ئۈچۈن ، بىز SW620 ھۈجەيرىسىنى ھەددىدىن زىيادە بېسىم قىلىدىغان PACT ، DARS-AS1 ياكى ھەر ئىككىسىنى ھاسىل قىلدۇق.PACT نىڭ ھەددىدىن زىيادە بېسىم قىلىشى ھۈجەيرىلەرنىڭ كۆپىيىشىنى كۆرۈنەرلىك چەكلىگەنلىكىنى كۆرسەتتى (3i رەسىم).گەرچە DARS-AS1 ھەددىدىن زىيادە بېسىم قىلىش ھۈجەيرىلەرنىڭ كۆپىيىشىنى كۆرۈنەرلىك ئىلگىرى سۈرگەن بولسىمۇ ، ئەمما ھۈجەيرىلەرنىڭ ھەددىدىن زىيادە بېسىم قىلىدىغان DARS-AS1 ۋە PACT نىڭ ئۆسۈش سۈرئىتىدە كۆرۈنەرلىك پەرق يوق.بۇ نەتىجىلەر PACT نىڭ DARS-AS1 ھەددىدىن زىيادە بېسىم كەلتۈرۈپ چىقارغان كۆپىيىشكە قارشى تۇرالايدىغانلىقىنى كۆرسىتىپ بەردى.
DARS-AS1 نىڭ ئوخشىمىغان رايونلىرىنىڭ ئوخشىمىغان PACT باغلاش ئىقتىدارى بولغاچقا ، بىز DARS-AS1 پارچىلىرىنى ھەددىدىن زىيادە بېسىم قىلىش ئارقىلىق ئۇلارنىڭ ھۈجەيرىلەرنىڭ كۆپىيىشىگە بولغان تەسىرىنى تەكشۈردۇق.باشقا ئىككى پارچىغا سېلىشتۇرغاندا ، DARS-AS1 DARS-AS1 دىكى PACT غا مۇناسىۋەتلىك ئاساسلىق رايون 3 ′ (384–768 nt) دە ھەددىدىن زىيادە بېسىم قىلىنغان ، بۇ ھۈجەيرىلەرنىڭ كۆپىيىشىنى قوزغىتىش ئىقتىدارى ئەڭ يۇقىرى (3j رەسىم).بۇ نەتىجىلەر DARS-AS1 نىڭ باغلىنىش ئىقتىدارى بىلەن بىئولوگىيىلىك ئىقتىدارى ئوتتۇرىسىدىكى ئاكتىپ باغلىنىشنى كۆرسىتىپ بېرىدۇ.
PACT نىڭ ئاقسىلنى قوللايدىغان ئاقسىل ئىكەنلىكى خەۋەر قىلىنغان.شۇڭلاشقا ، بىز DARS-AS1 نىڭ ئاپپتوزغا بولغان تەسىرىنى تەكشۈردۇق.ئويلىغىنىدەك ، DARS-AS1 سوقۇلۇش SW620 ھۈجەيرىسىدىكى PARP پارچىلىنىشنى كۆرۈنەرلىك ئاشۇرۇپ ، SW620 ، HCT116 ، HepG2 ۋە MBA-MD-231 ھۈجەيرىلىك لىنىيىدىكى ئاننىكسىن V مۇسبەت ھۈجەيرىلەرنىڭ نىسبىتىنى ئاشۇردى (3k رەسىم).3).3f - h) ، DARS-AS1 نىڭ راك ھۈجەيرىسىدىكى ئاپپتوتىكقا قارشى تۇرۇش ئۈنۈمىنىڭ PACT نىڭ ئاپپتوزوز پەيدا قىلىش ئىقتىدارىغا زىت ئىكەنلىكىنى كۆرسىتىپ بېرىدۇ.ئومۇملاشتۇرغاندا ، بۇ نەتىجىلەر DARS-AS1 ئونكېگېنلىق ئىقتىدارنىڭ مېخانىزىمىنىڭ PACT ئىقتىدارىنى چەكلەش ئارقىلىق بولۇشى مۇمكىنلىكىنى كۆرسىتىپ بېرىدۇ.
كېيىنكى قەدەمدە ، بىز DARS-AS1-PACT بىرلەشمىسىنىڭ ئىقتىدار جەھەتتىكى تەسىرى ئۈستىدە ئىزدەندۇق.PACT نىڭ بىۋاسىتە ئۆز-ئارا تەسىر قىلىش ئارقىلىق PKR نى قوزغىتىدىغانلىقى خەۋەر قىلىنغان بولۇپ ، كېيىن eIF2α فوسفورلىنىشنى كۈچەيتىپ ، تەرجىمىنى ئۆچۈرۈش ۋە ئاپتوماتىك داۋالاشنى كەلتۈرۈپ چىقىرىدۇ.ئالدى بىلەن ، DARS-AS1 نىڭ PACT ۋە PKR نىڭ ھۈجەيرە يەرلىكلەشتۈرۈلۈشىگە تەسىر كۆرسىتەمدۇ يوق تەكشۈردۇق.زىددىيەتلىك فلۇئورېسسېنسىيە مىكروسكوپتا كۆرسىتىلىشىچە ، PACT ۋە PKR SW620 ھۈجەيرىسىدە يۇقىرى دەرىجىدە بىرىكتۈرۈلگەن بولۇپ ، ئوتتۇرىچە Pearson نىڭ باغلىنىش كوئېففىتسېنتى 0.72.شۇنىڭ بىلەن بىر ۋاقىتتا ، DARS-AS1 ھەددىدىن زىيادە بېسىم قىلىش PACT ۋە PKR نىڭ يەرلىكلەشتۈرۈلۈشىنى كۆرۈنەرلىك تۆۋەنلەتتى (Pearson نىڭ باغلىنىش كوئېففىتسېنتى 0.61) (4a رەسىم).DARS-AS1 نىڭ PACT-PKR ئۆز-ئارا تەسىرلىشىشىنى ئۆزگەرتەلەمدۇ يوق تەكشۈرۈش ئۈچۈن ، بىز SW620 ھۈجەيرە لىماتسىيىسىدىكى PACT غا قارشى ئانتىتېلا بىلەن ئورتاق ئىممۇنىتېتقا قارشى تۇرۇش (ئورتاق IP) تەكشۈرۈشىنى ئېلىپ باردۇق.PKR كونترول ھۈجەيرىسىدىكى PACT قا قارشى تۇرۇشتا يۇقىرى دەرىجىدە بېيىغان ، PKR نىڭ ئەسلىگە كېلىشى ھۈجەيرىلەرنىڭ ھەددىدىن زىيادە بېسىم قىلىدىغان DARS-AS1 ھۈجەيرىسىدىكى لىزاتلاردا كۆرۈنەرلىك تۆۋەنلىگەن (4b رەسىم).ساپلاشتۇرۇلغان PACT ۋە PKR ۋىرۇسلۇق ئاقسىلنى باغلاشتا ئىشلىتىلىدۇ.بۇنىڭغا ئاساسەن ، DARS-AS1 نى تەمىنلىگەن ، ئەمما كونترول قىلالمىغان RNA بېسىلغان PACT-PKR ئۆز-ئارا تەسىرنى كۆرسەتتى (4c رەسىم).بارلىق نەتىجىلەر DARS-AS1 نىڭ PACT ۋە PKR ئالاقىسىنى ئۈزگەنلىكىنى كۆرسەتتى.
كونترول ھۈجەيرىسى ياكى ھۈجەيرىلەردە ھەددىدىن زىيادە بېسىم قىلىدىغان DARS-AS1 دىكى PACT ۋە PKR نىڭ يەرلىكلەشتۈرۈلۈشى فوكۇس فلۇئورېسسېنسىيىسى مىكروسكوپ ئارقىلىق كۆزىتىلدى.يادروسى DAPI بىلەن بويالغان.16 پارچە سۈرەتتىن ستاتىستىكا نەتىجىسى ئېلىنغان.b ئورتاق ئىممۇنىتېتلاش (بىرلەشمە IP) كونترول SW620 ھۈجەيرىسى ياكى DARS-AS1 ھۈجەيرىسىنى ھەددىدىن زىيادە بېسىم قىلىدىغان ھۈجەيرە لىماتلىرىدا PACT غا قارشى ئانتىتېلا ئىشلىتىپ.c بەلگە قويۇلغان PACT ، ساپلاشتۇرۇلغان PKR ۋە DARS-AS1 ياكى تەقلىدى RNA بىلەن ۋىرۇستا كۆچۈرۈلگەن ۋىرۇس ئاقسىلىنى باغلاش ئانالىزىغا سىڭدۈرۈلگەن.ئىممۇنىتېتنىڭ ئالدىنى ئېلىش ئۈچۈن بايراققا قارشى ئانتىتېلا ئىشلىتىلگەن.d كۆرسىتىلگەن ئانتىتېلا بار ئىممۇنىتېت سىستېمىسى SW620 ۋە HCT116 ھۈجەيرىسىدە كونترول shRNA ياكى DARS-AS1-shRNA بىلەن ئالماشتۇرۇلغاندىن كېيىن قان زەردابى ئاچارچىلىقتا ئېلىپ بېرىلدى.e DARS-AS1 ئىپادىلەش سەۋىيىسى ھۈجەيرىلەرنىڭ سەزگۈرلۈكىنى thapsigargin غا ئۆزگەرتتى.SW620 ھۈجەيرىسى DARS-AS1 shRNA ، DARS-AS1 ھەددىدىن زىيادە بېسىم پلازمىسى ياكى كونترول پىلازمىسى بىلەن ئالماشتۇرۇلدى.ھۈجەيرىلەر تاپسىگارگىن بىلەن 48 سائەت داۋالىنىپ ، MTS رېئاكتورى ئارقىلىق ھۈجەيرىلەرنىڭ ھاياتىي كۈچى بېكىتىلدى.f ۋىرۇستا كۆچۈرۈلگەن DARS-AS1 ياكى تۇتۇق RNA ۋە ساپلاشتۇرۇلغان PACT ۋىرۇسنى ئاكتىپلاش ۋە ئىممۇنىتېتنى تەكشۈرۈشتە ئىشلىتىلگەن.g بۇ ئانتىتېلانى ئىشلىتىپ ئىممۇنىتېت سىستېمىسى SW620-ctrl ھۈجەيرىسىدە (سولدا) ياكى PKR ئۆزگىرىشچان ھۈجەيرىلەرنى ھەددىدىن زىيادە بېسىم قىلىدىغان ھۈجەيرىلەردە ئېلىپ بېرىلدى.ئاندىن بۇ ھۈجەيرىلەر كونترول shRNA ياكى DARS-AS1-shRNA ئارقىلىق قان زەردابىدىن ئاچ قالغان.h Flow cytometry نىڭ كۆرسىتىشىچە ، ئۆزگىرىشچان PKR نىڭ ئاكتىپسىزلىنىشى SW620 ھۈجەيرىسىدىكى DARS-AS1 كەلتۈرۈپ چىقارغان ئاپپتوز كېسىلىنى تولۇقلىغان.مەن كۆرسىتىلگەن ئانتىتېلا بار Immunoblots SW620 (سولدا) ياكى HCT116 (ئوڭ) ھۈجەيرىلەردە ئېلىپ بېرىلدى.كونترول shRNA ياكى DARS-AS1 shRNA ئارقىلىق ئالماشتۇرۇلغان ھۈجەيرىلەردە قان زەردابى كەمچىل بولۇپ ، 100 nM PKR C16 چەكلىگۈچ ياكى DMSO تولۇقلىنىدۇ.كىچىك بالداق = 5 µm.كۆرسىتىلگەن سانلىق مەلۇماتلار ئۈچ خىل سىناقنىڭ ئوتتۇرىچە ± ئۆلچەملىك ئايلىنىشى.* p ≤ 0.05 ئىككى قۇيرۇقلۇق ئوقۇغۇچىلارنىڭ T سىنىقى.
ئادەتتە PACT PKR17 بىلەن ئۆز-ئارا تەسىر كۆرسەتكەندىن كېيىن ، Thr451 دىكى PKR فوسفورلىنىشنى كەلتۈرۈپ چىقىرىدۇ دەپ قارىلىدۇ.نەتىجىمىز قان زەردابىدىن ئاچ قالغاندىن كېيىن DARS-AS1 سوقۇلۇش ھۈجەيرىسىدە PKR فوسفورلىنىشنىڭ سەۋىيىسىنىڭ كۆرۈنەرلىك يۇقىرى كۆتۈرۈلگەنلىكىنى كۆرسەتتى (4d رەسىم ۋە قوشۇمچە 4a رەسىم).بۇنىڭغا ئاساسەن ، ئاساسلىق PKR تارماق ئېلېمېنتى eIF2α نىڭ فوسفورلىنىشنىڭ DARS-AS1 shRNA نىڭمۇ كۆرۈنەرلىك ئاشقانلىقىنى بايقىدۇق (4d رەسىم ۋە قوشۇمچە 4a رەسىم).Thapsigargin بولسا ER بېسىم بولۇپ ، ER نىڭ Ca2 + نى قويۇپ بېرىشىنى كەلتۈرۈپ چىقىرىدۇ.Tapsigargin بىلەن داۋالاشنىڭ PACT نىڭ ئىپادىلىنىشى ۋە قوزغىتىلىشىنى ئىلگىرى سۈرىدىغانلىقى خەۋەر قىلىنغان بولۇپ ، بۇ PKR بىلەن تېخىمۇ ئۆز-ئارا تەسىر كۆرسىتىدۇ ۋە ئاكتىپلايدۇ ، eIF2α فوسفورلىنىشنى 18،61 ئاشۇرۇش ئارقىلىق ئاپپتوز كېسىلىنى كەلتۈرۈپ چىقىرىدۇ.بۇ يەردە ، بىز Thapsigargin نى PACT / PKR يولىنى غىدىقلىغۇچى قىلىپ ئىشلىتىپ ، DARS-AS1 نىڭ PACT / PKR يولىنى چەكلەش ئارقىلىق ھۈجەيرىلەرنىڭ بېسىمنى يېڭىشىگە ياردەم بېرەلەيدىغان ياكى قىلالمايدىغانلىقىنى تەكشۈردۇق.بىز DARS-AS1 ئىپادىلەش دەرىجىسىنىڭ ھۈجەيرىلەرنىڭ تاپسىگارگىنغا قارشى تۇرۇش ئىقتىدارى بىلەن ئوڭ تاناسىپلىق مۇناسىۋىتى بارلىقىنى بايقىدۇق.SW620 ھۈجەيرىسى ھەددىدىن زىيادە بېسىم قىلىدىغان DARS-AS1 تاپىسارگىن بىلەن داۋالىغاندا تېخىمۇ ياخشى ھايات قالدى ، DARS-AS1 سوقۇلغان ھۈجەيرىلەر ئاسان ئاسان يۇقۇملاندى (4e رەسىم).بۇ نەتىجىلەرگە ماس ھالدا ، DARS-AS1 ھەددىدىن زىيادە بېسىم قىلىش تاپسىگارگىن كەلتۈرۈپ چىقارغان PKR فوسفورلىنىشنى ئازايتتى (قوشۇمچە 4b رەسىم).بۇنىڭغا سېلىشتۇرغاندا ، Tapsigargin داۋالاشتىن كېيىن ، PKR ۋە eIF2α كونترول ھۈجەيرىسىگە سېلىشتۇرغاندا DARS-AS1 سوقۇلۇش ھۈجەيرىسىدە تېخىمۇ يۇقىرى فوسفورلانغان (قوشۇمچە 4b رەسىم).قىزىقارلىق يېرى ، Thapsigargin مىقدارىغا تايىنىش شەكلىدە DARS-AS1 ئىپادىسىنى قوزغىغان ، بۇ بەلكىم DARS-AS1 نىڭ بېسىمغا قارشى تۇرۇش ئىقتىدارىنى كۆرسىتىشى مۇمكىن (قوشۇمچە 4c رەسىم).ئۇنىڭدىن باشقا ، بىز بۇ كۆزىتىشلەرنى دەلىللەش ئۈچۈن ۋىرۇس ئاكتىپلاش ئەسۋابىدا ئىشلىدۇق.قىسقىچە قىلىپ ئېيتقاندا ، PKR PKR غا قارشى ئانتىتېلا ئىشلىتىپ ھۈجەيرە لىماتلىرىدىن ساپلاشتۇرۇلدى ، ئاندىن قايتا ھاسىل بولغان PACT ۋە DARS-AS1 ۋىرۇسقا كۆچۈرۈلدى.فېرمېنتلىق رېئاكسىيەدىن كېيىن ، فوسفو- PKR WB ئارقىلىق بايقالغان.نەتىجىمىز PKR فوسفورلىنىشنىڭ DARS-AS1 تەرىپىدىن كۆرۈنەرلىك دەرىجىدە چەكلەنگەنلىكىنى ، ئەمما RNA كونترول قىلمايدىغانلىقىنى كۆرسەتتى (4f رەسىم).بۇلار ۋىرۇس ۋە vivo نەتىجىسىدە DARS-AS1 نىڭ PACT ۋاسىتىلىك PKR قوزغىتىشنى چەكلەيدىغانلىقىنى كۆرسىتىپ بېرىدۇ.شۇنىڭ بىلەن بىر ۋاقىتتا ، بىز يەنە DARS-AS1 نىڭ ئالدىدا PACT ئەسلىگە كېلىشنىڭ تۆۋەنلىگەنلىكىنى كۆردۇق (4f رەسىم).بۇ نەتىجە ۋىرۇس ئاقسىلى باغلاش ئەسۋابى (4c رەسىم) نىڭ نەتىجىسى بىلەن بىردەك بولۇپ ، PART-PKR بىرلەشمىسى ئۈچۈن DARS-AS1 نىڭ توسۇش ئىقتىدارىنى يەنە بىر قېتىم چۈشەندۈرۈپ بېرىدۇ.
PACT نىڭ D3 ساھەسىدىكى Ser246 ۋە Ser287 ھۈجەيرە بېسىمى ئاستىدا PKR قوزغىتىش ئۈچۈن تەلەپ قىلىنىدۇ.ئالانىنغا ئىككى خىل سېرېن قالدۇقىنىڭ ئالماشتۇرۇلۇشى ئۆزگىرىشچان PACT (mutD) بەردى ، بۇ بېسىم بولمىغان ئەھۋالدا PKR نى قوزغىتىدۇ ، ئالانىن (mutA) نىڭ ئورنى كېلىشىمنى ئۆزگەرتتى.بىز بۇ ساھەنىڭ DARS-AS1 بىلەن بىۋاسىتە باغلىنىشتا موھىملىقىنى نامايان قىلغانلىقىمىز ئۈچۈن ، بىز بۇ ئىككى PACT ئۆزگەرتكۈچىنى ھاسىل قىلىپ ، بۇ قالدۇق ماددىلارنىڭ DARS-AS1 بىلەن ئۆز-ئارا تەسىر كۆرسىتىشكە چېتىشلىق ياكى ئەمەسلىكىنى سىنىدۇق.قىزىقارلىق يېرى ، ھەر ئىككى خىل ئۆزگىرىشچان DARS-AS1 (قوشۇمچە رەسىم 4d) بىلەن باغلىنىش ئىقتىدارىنى يوقىتىپ ، DARS-AS1 بىلەن ئۈنۈملۈك ئۆز-ئارا تەسىر كۆرسىتىش ئۈچۈن PACT ئاقسىلىنىڭ تولۇق قۇرۇلمىسىنىڭ تەلەپ قىلىنىشى مۇمكىنلىكىنى ئوتتۇرىغا قويدى.
ئۇندىن باشقا ، بىزنىڭ نەتىجىمىز يەنە DARS-AS1-shRNA كەلتۈرۈپ چىقارغان ھۈجەيرىلەرنىڭ كۆپىيىشىنى چەكلەشنى كونترول قىلىدىغان سەلبىي PACT ئۆزگەرتكۈچى (PACTmutA) ياكى ھۆكۈمرانلىق مەنپىي PKR ئۆزگەرتكۈچى (PKRmut) نى ھەددىدىن زىيادە بېسىش ئارقىلىق قىسمەن ئەسلىگە كەلتۈرگىلى بولىدىغانلىقىنى ئوتتۇرىغا قويدى.ھۆكۈمرانلىق مەنپىي PKR ئۆزگىرىشچان ماددىلارنىڭ ھەددىدىن زىيادە بېسىم قىلىشى DARS-AS1 سوقۇلۇشتىن كېلىپ چىققان PKR فوسفورلىنىشنى شۇنداقلا قان زەردابىدىن ئايرىلغان ھۈجەيرىلەردە eIF2α فوسفورلىنىشنى ئازايتقان (4g رەسىم).تېخىمۇ مۇھىمى ، PKRmut نى ھەددىدىن زىيادە بېسىم قىلىدىغان ھۈجەيرىلەردە DARS-AS1 سوقۇلۇشتىن كېلىپ چىققان ئاپتوماتىك ھۈجەيرىلەرنىڭ نىسبىتىمۇ تۆۋەنلىدى (4h رەسىم ۋە قوشۇمچە 4g رەسىم).PKR كىنازا پائالىيىتىنى چەكلەش يەنە DARS-AS1 ئىقتىدارىنى بۇزىدۇ ، نەتىجىدە كۆرسىتىلىشچە ، DARS-AS1 سوقۇلۇش PKR ۋە eIF2α فوسفورلىنىشنى ناھايىتى ئاز قوزغىغان ، ھۈجەيرىلەر PKR بەلگىلىك C16 چەكلىگۈچ بىلەن بىر تەرەپ قىلىنغاندا (4i رەسىم ۋە قوشۇمچە 4h رەسىم).).يىغىپ ئېيتقاندا ، بىزنىڭ نەتىجىمىز DARS-AS1 نىڭ PACT ۋاسىتىچى PKR قوزغىتىشىنى چەكلەش ئارقىلىق ھۈجەيرىلەرنىڭ كۆپىيىشىنى ئىلگىرى سۈرىدىغانلىقىنى كۆرسىتىپ بېرىدۇ.
DARS-AS1 نىڭ ئۆسمە پەيدا بولۇشتىكى رولى ئۈستىدە يەنىمۇ ئىزدىنىش ئۈچۈن ، بىز vivo xenograft مودېلىنى ئىشلىتىپ vivo تەجرىبىسىدە ئىشلىدۇق. نەتىجىدە كۆرسىتىلىشىچە ، DARS-AS1 نىڭ سوقۇلۇشى چاشقانلارنىڭ ئۆسمىنىڭ ئۆسۈشىنى زور دەرىجىدە تۆۋەنلەتكەن (p قىممىتى <0.0001) (5a رەسىم). نەتىجىدە كۆرسىتىلىشىچە ، DARS-AS1 نىڭ سوقۇلۇشى چاشقانلارنىڭ ئۆسمىنىڭ ئۆسۈشىنى زور دەرىجىدە تۆۋەنلەتكەن (p قىممىتى <0.0001) (5a رەسىم). Результатя показывают, что аддаун DARS-AS1 رازكو снижает рост опухоли у мшей (значение p <0,0001) (رىس. 5а). نەتىجىدە كۆرسىتىلىشىچە ، DARS-AS1 سوقۇلۇش چاشقاندىكى ئۆسمىنىڭ ئۆسۈشىنى زور دەرىجىدە تۆۋەنلىتىدىكەن (p قىممىتى <0.0001) (5a رەسىم).结果 表明 AR DARS-AS1 的 敲 低 显 着 降低 小鼠 0. 0. 0. 0. p 值 <0.0001） （图 5a）。结果 表明 AR DARS-AS1 的 敲 低 显 着 降低 小鼠 0. 0. 0. 0. p 值 <0.0001） （图 5a）。 Результатя показали, что аддаун DARS-AS1 значительно снижает рост опухоли у мшей (значение р <0,0001) (رىس. 5а). نەتىجىدە كۆرسىتىلىشىچە ، DARS-AS1 سوقۇلۇش چاشقاندىكى ئۆسمىنىڭ ئۆسۈشىنى كۆرۈنەرلىك تۆۋەنلەتكەن (p قىممىتى <0.0001) (5a رەسىم).شۇڭا ، DARS-AS1 سوقۇلۇش گۇرۇپپىسىدا ، ئوتتۇرىچە ئۆسمىنىڭ مىقدارىدا تەخمىنەن% 72.9 ، ئوتتۇرىچە ئۆسمىنىڭ ماسسىسى% 87.8 تۆۋەنلىگەن (5b-d رەسىم).بۇ نەتىجىلەر DARS-AS1 نىڭ vivo ئۆسمىسىنىڭ ئۆسۈشىنى كۆرۈنەرلىك ئىلگىرى سۈرىدىغانلىقىنى كۈچلۈك كۆرسىتىپ بەردى.
ئېلان DARS-AS1 نىڭ يالىڭاچ چاشقاندىكى تۈز ئۈچەي ئۆسمىسىگە بولغان تەسىرى.ئۆسۈش ئەگرى سىزىقى (a) ، ئۆسمىنىڭ چوڭ-كىچىكلىكى (b) ، ئېغىرلىقى (c) ۋە ئۆسمە رەسىملىرى (d) كۆرسىتىلدى.خاتالىق بالدىقى ± SEM غا ۋەكىللىك قىلىدۇ. n = 10. **** p <0.0001 ، ئىككى قۇيرۇقلۇق ئوقۇغۇچىلارنىڭ T سىنىقى ئارقىلىق. n = 10. **** p <0.0001 ، ئىككى قۇيرۇقلۇق ئوقۇغۇچىلارنىڭ T سىنىقى ئارقىلىق. n = 10. **** p <0,0001 по дву зоннему критерию Стьюдента. n = 10. **** p <0.0001 ئىككى قۇيرۇقلۇق ئوقۇغۇچىلارنىڭ T سىنىقى.n = 10. **** p <0.0001 ， 通过 双 尾 学生 t 检验。 **** p <0.0001 ， 通过 双 尾 学生 t 检验。 **** p <0,0001 по дву зононнему критерию Стьюдента. **** p <0.0001 ئىككى قۇيرۇقلۇق ئوقۇغۇچىلارنىڭ T سىنىقى.e Kaplan-Meier UVM ، KICH ، KIRP ، MESO ، GBM ۋە LGG بىمارلىرىنىڭ DARS-AS1 ئىپادىلەش دەرىجىسى بىلەن ئومۇمىي ھاياتنىڭ باغلىنىشىنى تەھلىل قىلدى.بىمارلاردىكى يۇقىرى دەرىجىدىكى DARS-AS1 ئىپادىسى ئالدىنقى 50% ئىچىدەبىمارلاردىكى DARS-AS1 ئىپادىسىنىڭ تۆۋەن سەۋىيىسى% 50 تۆۋەن ئورۇندا تۇرغان.p- قىممىتى خاتىرە دەرىجىسى سىنىقى ئارقىلىق بېكىتىلدى.f DARS-AS1 نىڭ PACT-PKR يولى ۋە ئۆسمىنىڭ ئۆسۈشىنى تەڭشەيدىغان مودېل.
DARS-AS1 نىڭ كلىنىكىلىق تەسىرىنى تېخىمۇ ياخشى چۈشىنىش ئۈچۈن ، بىز ئۇنىڭ ئىپادىلىنىشى بىلەن بىمارلارنىڭ ھايات قېلىش ئوتتۇرىسىدىكى باغلىنىشنى تەكشۈردۇق.TCGA سانلىق مەلۇمات جەدۋىلىنى تەھلىل قىلىش ئارقىلىق ، تېخىمۇ يۇقىرى DARS-AS1 ئىپادىسىنىڭ سۈيدۈك يولى مېلانوما (UVM) ، بۆرەك خروموفوبىيىسى (KICH) ، بۆرەك قان تومۇر ھۈجەيرىسى راكى (KIRP) ، مېسوتېليوما (MESO) ، كۆپ خىللىق بىلەن مۇناسىۋەتلىك ئىكەنلىكىنى بايقىدۇق.تۆۋەن ھايات قېلىش گىلوبلاستوما مورفوزى (GBM) ۋە تۆۋەن دەرىجىدىكى مېڭە قان تومۇر ئۆسمىسى (LGG) بىمارلىرى بىلەن كۆرۈنەرلىك مۇناسىۋەتلىك (5e رەسىم).بۇ نەتىجىلەر DARS-AS1 نىڭ كلىنىكىلىق ئۆسمىنىڭ تەرەققىي قىلىشىدا موھىم رول ئوينايدىغانلىقىنى ۋە كۆپ خىل راكتىكى يوشۇرۇن ئالدىن پەرەز قىلىدىغان بىئولوگىيىلىك ماركا بولۇشى مۇمكىنلىكىنى كۆرسىتىپ بەردى.
بۇ تەتقىقاتتا ، چوڭ تىپتىكى CRISPRi فۇنكسىيەلىك تەكشۈرۈش ئارقىلىق ، DARS-AS1 lncRNA نىڭ PACT ۋە PKR دىن ئىبارەت ئىككى ئاچقۇچلۇق بېسىمنى كونترول قىلغۇچىنى تەڭشەش ئارقىلىق راك ھۈجەيرىسىنىڭ بېسىمىنى يېڭىدىغانلىقىنى ئېنىقلىدۇق.PACT بىلەن بىۋاسىتە ئۆز-ئارا تەسىر قىلىش ئارقىلىق ، DARS-AS1 PACT ئارقىلىق مۇرەسسە قىلىنغان PKR قوزغىتىشنى چەكلەپ ، ئاپتوماتىك ھۈجەيرىلەرنىڭ ئۆلۈشىنىڭ ئالدىنى ئېلىپ ، ھۈجەيرىلەرنىڭ كۆپىيىشىنى ئىلگىرى سۈرىدۇ (5f رەسىم).DARS-AS1 نىڭ تەڭشىلىشى كۆپ خىل راكلاردا كۆرۈلگەن بولۇپ ، ئۇنىڭ بېسىم شارائىتىدا راك ھۈجەيرىسىنىڭ ھاياتلىقىنى ئىلگىرى سۈرۈش رولى كۆپ خىل راكقا كەڭ قوللىنىلىشى مۇمكىنلىكىنى كۆرسىتىپ بېرىدۇ.
PACT PKR ئاكتىپلاشتۇرغۇچى ئاقسىل دەپ بېكىتىلدى ، PACT ۋاسىتىچى PKR قوزغىتىش ترانسكرىپسىيە ، تەرجىمە ، ئاپتوماتىك داۋالاش ۋە باشقا مۇھىم ھۈجەيرە جەريانلىرىنى تەڭشەش ئارقىلىق بېسىمغا تاقابىل تۇرۇشتا مۇھىم رول ئوينايدۇ.نەچچە ئون يىلدىن بۇيان ، PACT-PKR كاسسىسىنىڭ راكقا مۇناسىۋەتلىك بەلگىلىمىسىنى چۈشىنىشكە ئۇرۇندى.بۇ يەردە ، تەتقىقاتىمىز ھۈجەيرە lncRNA DARS-AS1 ئارقىلىق راك ھۈجەيرىسىدىكى PACT-PKR نى تەڭشەشنىڭ ئوخشىمىغان مېخانىزمىنى ئاشكارىلىدى ، بۇ PACT بىلەن بىۋاسىتە باغلىنىدۇ ، PACT-PKR ئۆز-ئارا تەسىرنى توسىدۇ ، PKR نىڭ ئاكتىپلىنىشى ۋە eIF2α فوسفورلىنىشنى چەكلەيدۇ ، بۇ ئارقىلىق بېسىم كەلتۈرۈپ چىقىرىدىغان ئاپپتوزوز ۋە تورمۇزلىنىشنى تىزگىنلەيدۇ. ئاخىرىدا راكنىڭ كۆپىيىشىنى غىدىقلايدۇ.ھۈجەيرىلەر.بۇ بايقاش راكنى ئالدىن پەرەز قىلىش ۋە داۋالاشتىكى يوشۇرۇن lncRNA نىشانلىرىنى يورۇتۇپ بەردى.
سانلىق مەلۇماتلىرىمىزدا كۆرسىتىلىشىچە ، DARS-AS1 سوقۇلۇش فوسفورلانغان PKR ۋە eIF2α نىڭ كۆرۈنەرلىك ئېشىشى بىلەن ھۈجەيرىلەرنى قان زەردابىدىن ئاچارچىلىققا سەزگۈرلەشتۈرگەن.بۇ نەتىجىلەر DARS-AS1 نىڭ PACT / PKR پائالىيىتىنى چەكلەش ئارقىلىق ناچار شارائىتتا راك ھۈجەيرىسىنىڭ ھاياتلىقىنى ئىلگىرى سۈرىدىغانلىقىنى كۆرسىتىپ بېرىدۇ.ASPACT ۋە nc886 غا ئوخشاش باشقا بىر قانچە كودلاشتۇرمايدىغان RNA لارمۇ PACT48 mRNA نى كونترول قىلىش ياكى PKR 49,50,64 بىلەن باغلاش ئارقىلىق ئاپتوماتىك فوسفورلىنىشنى تەڭشەش ئارقىلىق PACT / PKR ئوققا قاتناشقان.بۇنىڭ ئىچىدە DARS-AS1 PACT-PKR بىرلەشمىسىنىڭ قالايمىقانچىلىقى رولىنى ئوينايدۇ.بۇ تەتقىقات بىزنىڭ PACT / PKR ئوقنى تەڭشەش ۋە lncRNAs نىڭ بېسىم ئىنكاسىدىكى رولىغا بولغان تونۇشىمىزنى بېيىتتى.
PACT ئايرىم ئۈچ ساھەنى ئۆز ئىچىگە ئالىدۇ.ئالدىنقى ئىككى dsRBDs نىڭ ھەر بىرى PACT نىڭ PKR بىلەن بولغان يېقىنلىق باغلىنىشىنى ئەمەلگە ئاشۇرۇش ئۈچۈن يېتەرلىك ، ئۈچىنچى ساھە (D3) بولسا PKR نىڭ ۋىرۇس ۋە vivo دا ئاكتىپلىنىشى ئۈچۈن تەلەپ قىلىنىدۇ.تەتقىقاتىمىز DARS-AS1 نىڭ D3 تور دائىرىسى بىلەن ئۆز-ئارا تەسىر كۆرسىتىدىغانلىقىنى كۆرسەتتى (3h رەسىم).LncRNA (768 يادروسى) نىڭ چوڭ-كىچىكلىكىنى كۆزدە تۇتقاندا ، DARS-AS1 نىڭ D3 بىلەن باغلىنىشى dsRBD بىلەن PKR نىڭ PACT تور نامىنىڭ ئۆز-ئارا تەسىر قىلىشىنى جىسمانى جەھەتتىن چەكلىيەلەيدۇ ، بۇ ئارقىلىق PACT بىلەن PKR بىرلەشمىسىنى توسىدۇ.D3 دىكى Ser246 ۋە Ser287 نىڭ ئورنىنى ئالغان PACT نۇقتا ئۆزگىرىشى ئۇنىڭ DARS-AS1 بىلەن بولغان باغلىنىشچانلىقىنى بۇزۇپ تاشلاپ ، D3 ′ نىڭ ئومۇمىي قۇرۇلما ۋە ئېلېكتر خۇسۇسىيىتىنىڭ ئۇلارنىڭ جەمئىيىتىدىكى مۇھىملىقىنى كۆرسىتىپ بەردى.كەلگۈسىدە تېخىمۇ ئېنىق بولغان بىئو-خىمىيىلىك ئانالىز ۋە يۇقىرى ئېنىقلىقتىكى PACT قۇرۇلما ئانالىزىدىن پايدىلىنىپ ، بۇ مېخانىزىمنىڭ تېخىمۇ تەپسىلىي تەپسىلاتلىرى تەلەپ قىلىنىدۇ.
ئىلگىرىكى تەتقىقاتلاردا دېيىلىشىچە ، DARS-AS1 بىر قانچە مېخانىزم ئارقىلىق ھۈجەيرىلەرنىڭ كۆپىيىشىنى ئىلگىرى سۈرىدىكەن.بىر مىسالدا ، تەكشۈرگۈچىلەر DARS-AS1 نىڭ بۆرەك راكى ھۈجەيرىسىدىكى miP-194-5p نى نىشانلاپ ، ئانتىتېلاغا قارشى ئاقسىل كودلاشتۇرۇلغان DARS گېنىنى تەڭشەيدىغانلىقىنى بايقىدى.قانداقلا بولمىسۇن ، ھازىرقى تەتقىقاتتا ، DARS-AS1 سوقۇلۇشنىڭ ئاز دېگەندە تۈز ئۈچەي ، كۆكرەك ۋە جىگەر راكىنى ئۆز ئىچىگە ئالغان كۆپ خىل راكتىكى DARS تىرانسپورتىغا ئازراق تەسىر كۆرسەتكەن.LncRNAs ھۈجەيرە ۋە توقۇلمىلارغا خاس ئىپادىلەش ئەندىزىسىنى نامايان قىلغاچقا ، راك تىپلىرىدا ئىقتىدار مېخانىزىمى ساقلانماسلىقى مۇمكىن ، بۇ بىزنىڭ كۆزىتىشىمىز بىلەن ئوخشىمىغان راكلارنى ئىلگىرىكى باھالىشىمىز ئوتتۇرىسىدىكى ئوخشىماسلىقنى كەلتۈرۈپ چىقىرىشى مۇمكىن.ھەر خىل فىزىئولوگىيىلىك ۋە پاتولوگىيىلىك جەريانلارنىڭ كونكرېت مېخانىزىمىنى ئايدىڭلاشتۇرۇش ئۈچۈن ئالاھىدە تەتقىقاتلار لازىم.
كلىنىكىلىق سانلىق مەلۇماتلارنى ئانالىز قىلىش ئارقىلىق DARS-AS1 ئۆسمىنىڭ ئىپادىلىنىشىنىڭ راك بىمارلىرىنىڭ ھايات قېلىشى بىلەن تەتۈر تاناسىپلىق مۇناسىۋىتى بارلىقىنى كۆرسىتىپ بەردى ، بۇ DARS-AS1 / PACT / PKR ئوقنىڭ راكنى ئالدىن پەرەز قىلىشتىكى مۇھىملىقىنى تەكىتلىدى.خۇلاسىلىگەندە ، تەتقىقاتىمىز DARS-AS1 نىڭ PACT / PKR سىگنال ئوقىنىڭ تەڭشىگۈچىسى ئىكەنلىكىنى ، راك ھۈجەيرىسىنىڭ كۆپىيىشىنى ئىلگىرى سۈرىدىغانلىقىنى ۋە بېسىمغا تاقابىل تۇرۇش جەريانىدا ئاپتوماتىك داۋالاشنى تىزگىنلەيدىغانلىقىنى كۆرسىتىپ بەردى ، بۇ تەتقىقات يەنە بىر قۇر تەتقىقات بىلەن تەمىنلەيدۇ ھەمدە كەلگۈسىدىكى يوشۇرۇن داۋالاشقا قىزىقىدۇ. .
ئىنسانلارنىڭ ھۈجەيرە لىنىيىسى SW620 ، A549 ، MBA-MD-231 ، HCT116 ، HepG2 ۋە HEK293T جۇڭگودىكى دۆلەتلىك ھۈجەيرە لىنىيىسى بايلىق ئۇل ئەسلىھەلىرىدىن ئېلىنغان.بارلىق ھۈجەيرىلەر DMEM ۋاستىسى (DMEM ، تېرمو فىشېر ئىلمىي ، ۋالتام ، MA) دا% 10 FBS (Gemini, Brooklyn, NY) ۋە% 1 لىك پېنىتسىللىن-سترېپتومىيسىن (تېرمو فىشېر ئىلمىي) 37 سېلسىيە گرادۇس ،% 5 CO2 تولۇقلاندى.incubator.
PACT قا قارشى تۇرۇش ، ئابكام (ab31967)PKR غا قارشى تۇرۇش ، ئابكام (ab184257)PKR غا قارشى تۇرۇش (فوسفو- T451) ، ئابكام (ab81303)بايراققا قارشى تۇرۇش ، ئابكام (ab125243)Anti-eIF2α, Abcam (A0764));anti-eIF2α (فوسفور S51) ، ئابكام (ab32157)PACT غا قارشى (فوسفور S246) ، Abgent (AP7744b)anti-tubulin, CST (2128);نورمال مائۇس IgG, CST (5415S);نورمال توشقان IgG ، CST (2729S).ئانتىتېلا غەربنىڭ پارچىلىنىشى ئۈچۈن PBST دا 1: 1000 ، IP ئۈچۈن 1: 100 سۇيۇلدى.
sgRNAs CRISPR-ERA66 دەپ ئاتىلىدىغان ئاممىۋى قورالدىن پايدىلىنىپ ياسالغان.بىز sgRNA ئېچىش ئۈچۈن سۈكۈتتىكى قورال پارامېتىرلىرىنى ۋە 3 kb رايونىدىكى ھېسابلاش ھېسابلاش sgRNA باغلاش تور بېكەتلىرىنى قوللاندۇق.TSS نى مەركەز قىلغان.SgRNA oligonucleotides نىڭ كۆلچەكلىرى CustomArray ، Inc.جەمئىي 12 µg بىرىكتۈرۈلگەن ئىنسانپەرۋەرلىك pgRNA پىلازمىسى ، 7.2 µg psPAX2 (Addgene # 12260) ، ۋە 4.8 µg pMD2.G (Addgene # 12259) 10 سانتىمېتىرلىق تاماقتا DNA يۇقۇملىنىش رېئاكتورى ئارقىلىق 5 x 106 HEK293T غا ئالماشتۇرۇلدى. ھۈجەيرىلەر (CWBIO ، بېيجىڭ ، جۇڭگو) ئىشلەپچىقارغۇچىنىڭ كۆرسەتمىسى بويىچە.ۋىرۇس بار خاسىيەتلىك ماددىلار يۇقۇملانغاندىن كېيىن 48 ۋە 72 سائەتتىن كېيىن يىغىۋېلىنىپ ، 0.45 µm سۈزگۈچ ئارقىلىق سۈزۈلدى.تەكشۈرۈش ئۈچۈن ، dCas9 / KRAB بىرىكتۈرۈش ئاقسىلىنى ئىپادىلەيدىغان SW620 ھۈجەيرىسى ۋىرۇسنىڭ تارقىلىشى ئارقىلىق قولغا كەلتۈرۈلدى.ئۆزگەرتىلگەن SW620 ھۈجەيرىسى MOI دا 0.1-0.3 بولغان تۆت مۇستەقىل يۇقۇملىنىش تەجرىبىسىدە ۋىرۇس كۈتۈپخانىسى بىلەن يۇقۇملانغان ۋە 2 mg / ml puromycin (سىگما ، ساينىت لۇئىس ، MO) بىلەن 2 كۈن ئەۋرىشكە ئېلىنغان.ئۇنىڭدىن كېيىن ، ھۈجەيرىلەر ۋىرۇستا 18 كۈن يېتىلدۈرۈلۈپ ، ئەڭ ئاز كۈتۈپخانىنىڭ قاپلىنىش نىسبىتى 500 ھۈجەيرە / sgRNA بىلەن تەكشۈرۈلىدۇ.
گېن گۇرۇپپىسىنىڭ DNA سى QIAamp DNA قان مىدى يۈرۈشلۈك كىتابىنىڭ كۆرسەتمىسى بويىچە ئېلىنغان (QIAGEN ، دۇسسېلدورف ، گېرمانىيە ؛ 51183).ئومۇمىي جەھەتتىن ئېيتقاندا ، كۇتۇپخانىنى ياساشتا ھەر بىر بىئولوگىيىلىك تەكرارلاشتا 100 mg گېن گېن ئىشلىتىلگەن.SgRNA رايونى PCR نىڭ ئىككى ئايلانمىسى ئارقىلىق كۈچەيتىلگەن ۋە تاياقچە كودىغا ئۇلانغان.
PCR مەھسۇلاتلىرى NucleoSpin® گېلى ۋە PCR تازىلاش زاپچاسلىرى (MACHEREY-NAGEL ، دۇرېن ، گېرمانىيە ؛ 740609.250) ئارقىلىق ساپلاشتۇرۇلدى ۋە Qubit ™ HS قوش لىنىيىلىك DNA تەكشۈرۈش ئەسۋابى (Thermo Fisher Scientific; Q32854) ئارقىلىق مىقدارلاشتۇرۇلدى.
MTS تەكشۈرۈشى ھۈجەيرىلەرنىڭ كۆپىيىشىنى ئۆلچەشتە ئىشلىتىلگەن.ھۈجەيرىلەر دەسلەپكى قۇدۇقتىكى 2000 ھۈجەيرە / قۇدۇقتا 96 قۇدۇق تەخسىگە تېرىلدى.ھۈجەيرىلەرنىڭ نىسپىي سانى كۆرسىتىلگەن ۋاقىتتا ھەر كۈنى جەمئىي 4-6 كۈن ئۆلچەم قىلىنغان.ھەر بىر قۇدۇققا 20 مىللىمېتىرلىق MTS رېئاكتىۋسى (Promega) 100 مىللىمېتىر DMEM بىلەن سۇيۇلدۇرۇلدى ، 37 سېلسىيە گرادۇسلۇق 4 سائەت ھۈجەيرىلەر بىلەن سىڭدۈرۈلدى ، ئاندىن OD490 ئۆلچەم قىلىندى.
تەڭپۇڭسىز ئۆسۈش ئىقتىدارى شارنىڭ شەكىللىنىشىنى تەھلىل قىلىش ئارقىلىق بايقالغان.قىسقىچە قىلىپ ئېيتقاندا ، shRNA DARS-AS1 ياكى كونترول shRNA ئارقىلىق ئالماشتۇرۇلغان 2000 ھۈجەيرە ھەر 4 كۈندە ئوتتۇراھال ئۆزگىرىش بىلەن دەرىجىدىن تاشقىرى تۆۋەن قوشۇمچە مىكروپولات (Corning) دا يېتىشتۈرۈلدى.شارسىمان ماددىلار 14 كۈندىن كېيىن ھېسابلىنىدۇ.DARS-AS1 ھەددىدىن زىيادە بېسىم پلازمىسى ياكى كونترول پىلازمىسى بىلەن ئالماشتۇرۇلغان 500 ھۈجەيرە كۈچەيتمە ئەسۋابقا ئىشلىتىلگەن ، بولمىسا بۇ ئۇسۇل ئۆزگەرمىگەن.
RNA Riboprobe® بىرىكمە سىستېمىسى (Promega P1440) نىڭ كۆرسەتمىسى بويىچە T7 RNA پولىمېرازا ۋە بىئوتىن -16-UTP (Roche 1138908910) ئارقىلىق كۆچۈرۈلگەن.بۇ يەردە ئىشلىتىلگەن پىرىسلار قوشۇمچە 4-جەدۋەلدە كۆرسىتىلدى.
ئاقسىل كودلاش PACT ياكى PKR رايونلىرى pET15b (Addgene # 73619) غا كىلونلىنىپ ، BL21 (DE3) غا ئۆزگەرتىلدى.باكتېرىيە بىر كېچىدىلا ئامپىسلىن بىلەن تەمىنلەنگەن LB دا سىڭدۈرۈلگەندىن كېيىن ، يېڭى LB بىلەن 100 ھەسسە سۇيۇلدى.ئوتتۇراھال OD600 0.8 گە يەتكەندە ، 1 mM IPTG ئاقسىلنىڭ ئىپادىلىنىشىگە قوشۇلدى.مۇلايىم سىلكىش بىلەن بىر كېچە يوشۇرۇنغاندىن كېيىن (° C 250 دە ° C 250) ، ھۈجەيرە پوستى مەركەزدىن قاچۇرۇش ئارقىلىق يىغىۋېلىندى (4000 rpm ، 10 مىنۇت ، 4 سېلسىيە گرادۇس).لىمفا بۇففېر (50 mM Tris ، pH 8.0 ، 250 mM NaCl ، 1 mM PMSF) دىكى ھۈجەيرە پوستىنى توختىتىڭ ۋە مۇزدا 30 مىنۇت تۇرغۇزۇڭ ، ئاندىن سونىكات (15 مىنۇت ، 5 سېكۇنت / مۇز ، مۇز ئۈستىدە) ۋە مەركەزدىن قاچۇرۇش (13،000) rpm)., 30 min, 4 ° С).ئاندىن خاسىيەتلىك كېمە Ni-NTA قالدۇقلىرى (QIAGEN) غا 3 سېلسىيە گرادۇستا 3 قېتىم قاچىلانغان ، يۇيۇش سۇيۇقلۇقى (50 mM Tris ، pH 8.0 ، 40 mM imidazole ، 250 mM NaCl) بىلەن 4 قېتىم يۇيۇلغان ۋە 3 قېتىم يۇقىرى كۆتۈرۈلگەن. 10 مىللىمېتىرلىق بۇففېرنىڭ (50 mM Tris ، pH 8.0 ، 250 mM NaCl ، 300 mM imidazole).ساپلاشتۇرۇلغان ئاقسىل WB ئارقىلىق بېكىتىلدى ، قويۇقلۇقى Qubit ™ ئاقسىل تەكشۈرۈش ئەسۋابى (Thermo Fisher Scientific; Q 33212) ئارقىلىق بېكىتىلدى.
RIP ئانالىزلىرى ئىلگىرى تەسۋىرلەنگەندەك ئۆزگەرتىلگەن.قىسقىچە قىلىپ ئېيتقاندا ، 1x RIP بۇففېر (25 mM Tris-HCl, pH 7.5, 100 mM NaCl, 0.5% NP-40, RNasin ribonuclease inhibitor (Promega), PMSF (Beyotime بىئوتېخنىكا) ، 1 mM DDM ، ئاقسىل) لىمون سىستوتاتىك 1 x 107 كوكتېل .ئاندىن خاسىيەتلىك ماددا ئاقسىل A + G ماگنىتلىق مونچاق (Millipore) بىلەن 5 mgg PACT غا قارشى ئانتىتېلا (Abeam) ياكى IgG (CST) بىلەن بىرىكتۈرۈلگەن.مونچاق 5x RIP بۇففېر بىلەن 5 قېتىم يۇيۇلدى ، ئاندىن ئاقسىل K (NEB) بىلەن ھەزىم قىلىندى.RNA Trizol بىلەن ئېلىنغان ۋە RT-qPCR تەرىپىدىن بېكىتىلگەن.قوشۇمچە ماتېرىياللار 5-جەدۋەلدە كۆرسىتىلدى.
In vitro RIP تەكشۈرۈشى ئۆزگەرتىلگەن ئۆلچەملىك RIP تەكشۈرۈش كېلىشىمىگە ئاساسەن ئېلىپ بېرىلدى.جەمئىي 5 pmol ۋىرۇسى كۆچۈرۈلگەن RNA RIP بۇففېر بىلەن 1x سۇيۇلدۇرۇلدى ۋە 65 سېلسىيە گرادۇسلۇق ئىنكۇباتسىيە ئارقىلىق 5 مىنۇت تۇرغۇزۇلدى ، ئاندىن ئاستا-ئاستا سوۋۇپ ئۆي تېمپېراتۇرىسى.جەمئىي 5 pmol مۇكەممەل ياكى ئۆزگەرتىلگەن بايراق بەلگىسى بار PACT ئاقسىلى E. coli دىن ساپلاشتۇرۇلدى.ئۆزگەرتىلگەن RNA بىلەن 2 سېلسىيە گرادۇس 2 سېلسىيە گرادۇسلۇق ھالەتكە كەلتۈرۈڭ ھەمدە بايراققا قارشى IP ئۈچۈن RIP ئانالىزىنىڭ يۇقىرىقى تەرتىپىگە ئەمەل قىلىڭ.
RNA كېڭەيتىش ئانالىزى ئۈچۈن ، 1 × 107 ھۈجەيرىگە 1xRIP بۇففېر چاپلانغان.چۈشتىن كېيىن سائەت 13 دىن 13 مىنۇت ئۆتكەندە 4 سېلسىيە گرادۇسلۇق 15 مىنۇتتا مەركەزدىن قاچقاندىن كېيىن ، خاسىيەتلىك كېمە 30 سېلسىيە گرادۇسلۇق سترېپتاۋىدىن ماگنىتلىق مونچاق (بېكمان) بىلەن 4 سېلسىيە گرادۇسلۇق ھاۋارايىدا 2 سائەت ئالدىن ياسالغان.ئاندىن ساپلاشتۇرۇلغان لىزات ئېچىتقۇ TRNA بىلەن تەمىنلىنىپ ، 40 سېلسىيە گرادۇسلۇق RNA بىلەن بىر كېچىدىلا 4 سېلسىيە گرادۇسلۇق سىلىندى ، ئاندىن يەنە 2 سائەت ۋە 20 مىللىمېتىرلىق يېڭى سترېپتاۋىدىن ماگنىتلىق مونچاق BSA بىلەن توسۇلدى.يۇيۇش باسقۇچى 5 ھەسسە RIP بۇففېر بىلەن 4 قېتىم ، 1x RIP بۇففېر بىلەن 4 قېتىمدىن تەركىب تاپقان.ماس كېلىدىغان ئاقسىللار بىئوتىن يوقىتىش بۇففېر (25 mM Tris-HCl, pH 7.5, 12.5 mM D-biotin, PMSF) بىلەن سۈزۈلۈپ ، NuPAGE دا% 4-12 لىك Bis-Tris Gel (Invitrogen) بىلەن ئايرىلدى.كۈمۈش داغ (Beyotime بىئوتېخنىكا) دىن كېيىن ، بىر قىسىم بەلۋاغلار MS تەرىپىدىن قېزىۋېلىندى ۋە ئانالىز قىلىندى.
PACT بىلەن PKR ئوتتۇرىسىدىكى ئۆز-ئارا تەسىرنى سىناش ئۈچۈن ئورتاق IP ئانالىز ئېلىپ بېرىلدى.قىسقىچە قىلىپ ئېيتقاندا ، خاسىيەتلىك لىزاتلار 1 x RIP بۇففېرغا 1 x 107 لىك لايلانغان ھۈجەيرىلەرنى سىڭدۈرۈپ ، 13 سېلسىيە گرادۇسلۇق مەركىزىدە 15 سېلسىيە گرادۇسلۇق تېمپېراتۇرا 15 سېلسىيە گرادۇستا 15 مىنۇت تۇرغۇزۇلدى.لەيلىلەرگە ئاقسىل A + G ماگنىتلىق مونچاق قاچىلانغان بولۇپ ، 5 µg PACT غا قارشى ئانتىتېلا بىلەن بىرىكتۈرۈلۈپ ، 4 سېلسىيە گرادۇستا ئاستا-ئاستا ئايلانغان.مونچاق 5 × RIP بۇففېر بىلەن 3 قېتىم يۇيۇلدى ، ئىككى قېتىم 1 × RIP بۇففېر بىلەن 1 × SDS بۇففېر بىلەن چىقىرىلدى.ئەسلىگە كەلتۈرۈلگەن ئاقسىل SDS-PAGE گېلى تەرىپىدىن ئانالىز قىلىنغان ۋە WB تەرىپىدىن بايقالغان.
بايراقلىق PACT نىڭ ئىككى چۈشتىن كېيىن ۋە PKR نىڭ چۈشتىن كېيىن سائەت 1 دە E. coli دىن ساپلاشتۇرۇلدى.1 × RIP بۇففېرنى سۇيۇلدۇرۇپ ، كەچ سائەت 10 دا ئۆزگەرتىلگەن RNA بىلەن 4 سېلسىيە گرادۇستا 2 سائەت سىڭدۈرۈڭ.ئۇنىڭدىن كېيىن ، ئۇلار ئاقسىل A + G ماگنىتلىق مونچاق ئۇلانغان بەلگە قارشى ئانتىتېلا بىلەن قوشۇمچە ئىككى سائەت سىڭدۈرۈلدى.ئاندىن بۇ مونچاقلار 1x RIP بۇففېر بىلەن تۆت قېتىم يۇيۇلۇپ ، 1x SDS بۇففېر بىلەن سۈزۈلگەن.نەتىجىدە PACT ۋە PKR WB تەرىپىدىن بايقالغان.