خەۋەرلەر

Nature.com نى زىيارەت قىلغىنىڭىزغا رەھمەت.سىز ئىشلىتىۋاتقان توركۆرگۈچ نۇسخىسىنىڭ CSS قوللىشى چەكلىك.ئەڭ ياخشى تەجرىبە ئۈچۈن يېڭىلانغان تور كۆرگۈچنى ئىشلىتىشىڭىزنى تەۋسىيە قىلىمىز (ياكى Internet Explorer دىكى ماسلىشىشچان ھالەتنى چەكلەڭ).بۇ جەرياندا ، داۋاملىق قوللاشقا كاپالەتلىك قىلىش ئۈچۈن ، تور بېكەتنى ئۇسلۇب ۋە JavaScript ئىشلەتمەيمىز.
ئاكتىپلاشتۇرۇلغان ئېستېر ياكى فېنوكىس رادىكاللىرىنى ئاساس قىلغان فېرمېنتلىق يېقىنلىق بەلگە قويۇش ئۇسۇللىرى جانلىق ھۈجەيرىلەردە ھۈجەيرە ئاقسىلى ۋە ئاقسىل ئۆز-ئارا تەسىر كۆرسىتىش خەرىتىسىنى كەڭ كۆلەمدە ئىشلىتىدۇ.قانداقلا بولمىسۇن ، ئاكتىپلانغان ئېستېرنىڭ ئاكتىپچانلىقى تۆۋەن بولىدۇ ، نەتىجىدە كەڭ بەلگە رادىئوسى پەيدا بولىدۇ ، ئوكسىدنى داۋالاش ئارقىلىق ھاسىل بولغان فېنوكىس رادىكاللىرى قىزىل نۇر يولىغا دەخلى قىلىدۇ.بۇ يەردە بىز miniSOG فوتوسىنتېزلاش ئاقسىلىنى قىزىقىش ئاقسىلى بىلەن گېن ئارقىلىق باغلاپ تەتقىق قىلىپ ياسالغان يېقىنلىق بەلگىسىگە تايىنىدىغان رەسىم ئاكتىپلاش (PDPL) ئۇسۇلىنى دوكلات قىلىمىز.كۆك نۇرنىڭ تۈرتكىسىدە ۋە ئاشكارلىنىش ۋاقتى تەرىپىدىن كونترول قىلىنغان يەككە ئوكسىگېن ھاسىل بولىدۇ ، ئاندىن ئانىلىن تەكشۈرۈشى ئارقىلىق گىستودىن قالدۇقىنىڭ بوشلۇقتا ئۆزلۈكىدىن ھەل قىلىنىشى ئەمەلگە ئاشۇرۇلىدۇ.بىز ئورگانىك ئالاھىدە ئاقسىل خەرىتىسى ئارقىلىق ئۇنىڭ يۇقىرى ساداقەتمەنلىكىنى نامايان قىلىمىز.PDPL بىلەن TurboID نى بىرمۇبىر سېلىشتۇرۇش PDPL نىڭ تېخىمۇ كونكرېت ۋە ئەتراپلىق ئاقسىل بىلەن قاپلىنىشىنى كۆرسىتىپ بېرىدۇ.كېيىنكى قەدەمدە ، بىز PDPL نى كېسەللىككە مۇناسىۋەتلىك ترانسكرىپسىيەلىك ئاكتىپلاشتۇرغۇچى BRD4 ۋە E3 Parkin ligase غا ئىشلىتىپ ، ئىلگىرى نامەلۇم ئۆز-ئارا ئالاقىلاشقۇچىلارنى تاپتۇق.ھەددىدىن زىيادە بېسىمنى تەكشۈرۈش ئارقىلىق ، پاركىن ئۈچۈن Ssu72 ۋە SNW1 دىن ئىبارەت ئىككى نامەلۇم تارماق بالا ئېنىقلاندى ، ئۇلارنىڭ بۇزۇلۇشى ھەممە يەرنى قاپلاش-ئاقسىل يولى ئارقىلىق ۋاسىتە قىلىنغان.
ئاقسىل تورىنىڭ توغرا ئالاھىدىلىكى نۇرغۇن ھۈجەيرە جەريانلىرىنىڭ ئاساسى.شۇڭلاشقا ، ئاقسىلنىڭ ئۆز-ئارا تەسىر كۆرسىتىشىنىڭ يۇقىرى ئېنىقلىق خەرىتىسى بىئولوگىيىلىك يوللارنى ، كېسەللىك پاتولوگىيىسىنى يېشىش ۋە داۋالاش مەقسىتىدە بۇ ئۆز-ئارا تەسىرنى قالايمىقانلاشتۇرۇشنىڭ مولېكۇلا ئاساسى بىلەن تەمىنلەيدۇ.بۇنىڭ ئۈچۈن تىرىك ھۈجەيرە ياكى توقۇلمىلاردىكى ۋاقىتلىق ئۆز-ئارا تەسىرنى بايقاش ئىقتىدارىغا ئىگە ئۇسۇللار تولىمۇ كۆڭۈلدىكىدەك.يېقىنلىقنى تازىلاش ئاممىۋى سپېكترومېتىرىيىسى (AP-MS) تارىختا مەنپەئەت ئاقسىلى (POIs) نىڭ باغلىنىشچان شېرىكلىرىنى ئېنىقلاشتا قوللىنىلغان.مىقدارلاشتۇرۇلغان ئاقسىل ئۇسۇلىنىڭ تەرەققىي قىلىشىغا ئەگىشىپ ، Bioplex3.0 قۇرۇلدى ، بۇ AP-MS نى ئاساس قىلغان ئاقسىل تورىنىڭ ئەڭ چوڭ سانلىق مەلۇمات ئامبىرى.گەرچە AP-MS ئىنتايىن كۈچلۈك بولسىمۇ ، ئەمما خىزمەت ئېقىمىدىكى ھۈجەيرە لىمزىسى ۋە سۇيۇلۇش باسقۇچلىرى ئاجىز ۋە ئۆتكۈنچى باغلىنىشلىق ئۆز-ئارا تەسىرگە مايىل بولۇپ ، لىزدىن ئىلگىرى بۆلەكلەر كەمچىل بولغان ئۆز-ئارا تەسىر كۆرسىتىش جۈپلىرى قاتارلىق لىزدىن كېيىنكى ئاسارە-ئەتىقىلەرنى تونۇشتۇرىدۇ.
بۇ مەسىلىلەرنى ھەل قىلىش ئۈچۈن ، ئۆز-ئارا ئۇلىنىش گۇرۇپپىسى ۋە يېقىن ئەتراپتىكى فېرمېنتلىق بەلگە (PL) سۇپىسى (مەسىلەن APEX ۋە BioID) 5 بولغان تەبىئىي بولمىغان ئامىنو كىسلاتاسى (UAA) بارلىققا كەلدى.گەرچە UAA ئۇسۇلى نۇرغۇن ئەھۋاللاردا مۇۋەپپەقىيەتلىك قوللىنىلىپ ، بىۋاسىتە ئاقسىل يېپىشقاقلىقى توغرىسىدا ئۇچۇر بىلەن تەمىنلىگەن بولسىمۇ ، ئەمما يەنىلا UAA قىستۇرما ئورنىنى ئەلالاشتۇرۇش تەلەپ قىلىنىدۇ.تېخىمۇ مۇھىمى ، ئۇ بەلگە خاراكتېرلىك ۋەقەلەرنىڭ كاتالىزاتورلۇق بۇرۇلۇشى كەمچىل بولغان ستوئىئومېتىرىيەلىك بەلگە قويۇش ئۇسۇلى.بۇنىڭغا سېلىشتۇرغاندا ، BioID ئۇسۇلىغا ئوخشاش فېرمېنتلىق PL ئۇسۇللىرى ئىنژېنېرلىق بىئوتىن لېگانىنى POI7 غا بىرىكتۈردى ، كېيىن بىئوتىن ئاكتىپلىنىپ ، ئاكتىپ بولغان بىئوتىن-AMP ئېستېر ئارىلىقىنى شەكىللەندۈرىدۇ.ئېنزىم شۇنىڭ بىلەن يېقىنلاشقان لىزېن قالدۇقىغا بەلگە قويۇلغان ئاكتىپلانغان بىئوتىن «بۇلۇت» نى قوزغىتىدۇ ۋە قويۇپ بېرىدۇ.قانداقلا بولمىسۇن ، BioID يېتەرلىك بەلگە قويۇلغان سىگنالغا ئېرىشىش ئۈچۈن 12 سائەتتىن ئارتۇق ۋاقىت تەلەپ قىلىدۇ ، بۇ ۋاقىتلىق ئېنىقلىق بىلەن ئىشلىتىشنى چەكلەيدۇ.ئېچىتقۇ ئېكرانىنى ئاساس قىلغان يۆنىلىشلىك تەدرىجىي تەرەققىياتنى ئىشلىتىپ ، TurboID BioID نى ئاساس قىلىپ لايىھەلەنگەن بولۇپ ، 10 مىنۇت ئىچىدە بىئوتىن بىلەن ئۈنۈملۈك بەلگە قويۇپ ، تېخىمۇ ھەرىكەتچان جەريانلارنى تەتقىق قىلالايدۇ.TurboID ئىنتايىن ئاكتىپ ۋە ئىچكى مەنبەلىك بىئوتىن سەۋىيىسى تۆۋەن دەرىجىدىكى بەلگە قىلىشقا يېتەرلىك بولغاچقا ، تاشقى بىئوتىن قوشۇش ئارقىلىق يۇقىرى كۆتۈرۈلگەن ۋە ۋاقىت بەلگىسى تەلەپ قىلىنغاندا تەگلىك بەلگىسى يوشۇرۇن مەسىلە بولۇپ قالىدۇ.ئۇنىڭدىن باشقا ، ئاكتىپلانغان ئېستېرنىڭ ئاكتىپچانلىقى تۆۋەن (t1 / 2 ~ 5 مىنۇت) ، بۇ چوڭ بەلگە رادىئوسىنى كەلتۈرۈپ چىقىرىدۇ ، بولۇپمۇ قوشنا ئاقسىللار بىئوتىن بىلەن تويۇنغاندىن كېيىن. فېنول رادىكاللىرى ۋە بىر مىنۇت ئىچىدە ئاقسىلنىڭ بەلگە قويۇلۇشىغا يول قويىدۇ. ھۈجەيرە جەريانلىرى.
شۇڭا ، ھۈجەيرە يولىنى كۆرۈنەرلىك دەخلى قىلماي ، بوشلۇق ۋە ۋاقىتلىق توغرىلىق دەرىجىسى يۇقىرى بولغان تېخىمۇ ئاكتىپ بولغان بەلگە خاراكتېرلىك رادىئاتسىيە بېسىش تۈرلىرىنى ھاسىل قىلالايدىغان يېڭى ئۇسۇل ھازىرقى ئۇسۇللارغا مۇھىم قوشۇلىدۇ. رېئاكسىيىلىك تۈرلەر ئىچىدە يەككە ئوكسىگېن ئۇنىڭ ئۆمرى قىسقا ۋە تارقىلىش دائىرىسى چەكلىك (ھۈجەيرىلەردە t1 / 2 <0.6 µs) سەۋەبىدىن دىققىتىمىزنى قوزغىدى. رېئاكسىيىلىك تۈرلەر ئىچىدە يەككە ئوكسىگېن ئۇنىڭ ئۆمرى قىسقا ۋە تارقىلىش دائىرىسى چەكلىك (ھۈجەيرىلەردە t1 / 2 <0.6 µs) سەۋەبىدىن دىققىتىمىزنى قوزغىدى. С كان агных форм наше внимание привлек синглетный Кидод из-за его короткого времени жизни и ограниченного чуса дифузии (t1 / 2 <0,6 мсек в клетках) 13. ئاكتىپ شەكىللەر ئىچىدە يەككە ئوكسىگېننىڭ ئۆمرى قىسقا ۋە تارقىلىش دائىرىسى چەكلىك (ھۈجەيرىلەردە t1 / 2 <0.6 µs) سەۋەبىدىن دىققىتىمىزنى تارتتى.1 活性 物质 中 ， 单线 态 氧 因其 短 1 1 1 1 1 1 1/2 <0.6 µs） 而 引起 了 我们 的 注意 13 С كان агных форм наше внимание привлекает синглетный Кизод из-за его короткого времени жизни и ограниченного чуса дифузии (t1 / 2 <0,6 мш в клетках). ئاكتىپ شەكىللەر ئىچىدە يەككە ئوكسىگېننىڭ ئۆمرى قىسقا ۋە تارقىلىش دائىرىسى چەكلىك (ھۈجەيرىلەردە t1 / 2 <0.6 μs) بولغاچقا دىققىتىمىزنى تارتىدۇ.يەككە ئوكسىگېننىڭ مېتونىن ، تىروسىن ، گىستودىن ۋە تىرىپتوفاننى ئىختىيارىي ئوكسىدلاشتۇرىدىغانلىقى ، ئامىن ياكى تىئولنى ئاساس قىلغان تەكشۈرۈش ئەسۋابىغا باغلىنىشى ئۈچۈن 1415 قۇتۇپقا ئايلانغانلىقى خەۋەر قىلىنغان.گەرچە يەككە ئوكسىگېن تارماق ھۈجەيرە بۆلۈمىنىڭ RNA بەلگىسىگە ئىشلىتىلگەن بولسىمۇ ، ئەمما ئىچكى مەنبەلىك POI يېقىنلىق بەلگىسىنى ئەسلىگە كەلتۈرۈش ئىستراتېگىيىسى تېخىچە تەتقىق قىلىنمىدى.بۇ يەردە بىز فوتوئاكتىپلاشتۇرۇشقا تايىنىدىغان يېقىنلىق بەلگىسى (PDPL) دەپ ئاتىلىدىغان بىر سۇپىنى تونۇشتۇرىمىز ، بۇ يەردە بىز كۆك نۇر ئىشلىتىپ ، miniSOG فوتوسېنېرلاشتۇرغۇچ بىلەن بىرىكتۈرۈلگەن POI لارنى يورۇتۇپ ، يەككە ئوكسىگېن ھاسىل قىلىپ ، قالدۇق ماددىلارنى ئوكسىدلاندۇرىمىز ، ئاندىن ئامىن بار بولغان خىمىيىلىك تەكشۈرۈشنى ئوكسىدلاشتۇرىمىز. ئارىلىقتىكى جانلىق ھۈجەيرىلەر..بىز بىر گۇرۇپپا خىمىيىلىك تەكشۈرۈش ئەسۋابىنى سىناق قىلىپ ، خەتكۈچنىڭ خاسلىقىنى ئەڭ يۇقىرى چەككە يەتكۈزدۇق ۋە ئوچۇق ئاقسىل خىزمەت ئېقىمى ئارقىلىق ئۆزگەرتىش تور بېكەتلىرىنى ئېنىقلىدۇق.PDPL بىلەن TurboID نى بىرمۇبىر سېلىشتۇرۇش PDPL نىڭ تېخىمۇ كونكرېت ۋە ئەتراپلىق ئاقسىل بىلەن قاپلىنىشىنى كۆرسىتىپ بېرىدۇ.بىز بۇ خىل ئۇسۇلنى راك ھۈجەيرىسىدىكى ئاقسىلنىڭ ئورگانىك بەلگىلىك بەلگىسى ۋە راكقا مۇناسىۋەتلىك ئېپىگېنتىك تەڭشەش ئاقسىلى BRD4 ۋە پاركىنسون كېسىلىگە مۇناسىۋەتلىك E3 ligase Parkin ئۈچۈن باغلىنىشلىق شېرىكلەرنىڭ ئادەتتىكى ئاقسىل پەرقلەندۈرۈش ئۇسۇلىغا قوللاندۇق ، بۇ ھەم مەلۇم ھەم نامەلۇم ئاقسىل تورىنى دەلىللىدى. ئۆز-ئارا تەسىر كۆرسىتىش..PDPL نىڭ چوڭ ئاقسىللار توپىدىكى E3 تارماق ئېلېمېنتلىرىنى تونۇش ئىقتىدارى ۋاسىتىلىك باغلىنىشنى ئېتىراپ قىلىش تەلەپ قىلىنغان ئەھۋالغا ۋەكىللىك قىلىدۇ.ھەممە يەرنى قاپلاش-ئاقسىل ئارقىلىق مۇرەسسە قىلىنغان ئىككى نامەلۇم پاركىننىڭ ئاستى قىسمى دەل جايىدا ئىسپاتلاندى.
فوتودىنامىكىلىق داۋالاش (PDT) 19 ۋە خروموفور ئارقىلىق لازېرنىڭ ئاكتىپسىزلىنىشى (CALI) 20 بولۇپ ، فوتوسىنتېزلاشتۇرغۇچ بىلەن نۇرنىڭ نۇرلىنىشى يەككە ئوكسىگېن ھاسىل قىلىدۇ ، نىشاندىكى ئاقسىلنى ئاكتىپسىزلاندۇرىدۇ ياكى ھۈجەيرىلەرنىڭ ئۆلۈشىنى كەلتۈرۈپ چىقىرىدۇ.يەككە ئوكسىگېن يۇقىرى رېئاكتىپلىق ماددا بولغاچقا ، نەزەرىيىۋى تارقىلىش ئارىلىقى تەخمىنەن 70 nm ، فوتوسېنېرلاشتۇرغۇچ ئەتراپىدىكى بوشلۇقتىكى ئوكسىدلىنىشنى كونترول قىلغىلى بولىدۇ.بۇ ئۇقۇمنى ئاساس قىلىپ ، يەككە ئوكسىگېن ئىشلىتىپ ، ھاياتلىق ھۈجەيرىسىدىكى ئاقسىل ماددىلىرىغا يېقىن بەلگە قويۇشنى قارار قىلدۇق.بىز تۆت خىل ئىقتىدارنى ئەمەلگە ئاشۇرۇش ئۈچۈن PDPL خىمىيىلىك ئاقسىل ئۇسۇلىنى تەتقىق قىلىپ چىقتۇق: (1) PL فېرمېنتلىق ئۇسۇلىغا ئوخشاش ئاكتىپ يەككە ئوكسىگېننىڭ ھاسىل قىلىنىشىنى قوزغىتىش ؛(2) يورۇقلۇق قوزغالغاندا ۋاقىت بەلگىلەش بەلگىسى بىلەن تەمىنلەش ؛(3) ئۆزگەرتىش ئارقىلىق (4) ئىچكى مەنبەلىك كوفاكتور (بىئوتىنغا ئوخشاش) ئىشلىتىپ ئارقا كۆرۈنۈشنى ئازايتىشتىن ساقلىنىڭ ياكى يۇقىرى دەرىجىدە چىرىتكۈچى تاشقى رېئاكتورنى (ئوكسىد ئوكسىدقا ئوخشاش) ئىشلىتىپ ، ھۈجەيرىلەرنىڭ مۇھىت بېسىمىغا بولغان تەسىرىنى ئەڭ تۆۋەن چەككە چۈشۈرۈڭ.
فوتوسېنېرلاشتۇرغۇچنى كىچىك مولېكۇلا ئېغىرلىقتىكى فتوروفور (مەسىلەن ئەتىرگۈل بېنگال ، مېتىلېن كۆك) 22 ۋە گېنى كودلانغان كىچىك ئاقسىل (مەسىلەن miniSOG ، KillerRed) دىن ئىبارەت ئىككى تۈرگە ئايرىشقا بولىدۇ.مودۇللۇق لايىھەنى ئەمەلگە ئاشۇرۇش ئۈچۈن ، POI24,25 غا فوتوسېنزلاشتۇرغۇچ (PS) ئاقسىلى قوشۇش ئارقىلىق بىرىنچى ئەۋلاد PDPL سۇپىسىنى تەرەققىي قىلدۇردۇق (1a رەسىم).كۆك نۇر بىلەن نۇرلاندۇرغاندا ، يەككە ئوكسىگېن يېقىن يادرولىق ئامىنو كىسلاتا قالدۇقىنى ئوكسىدلاشتۇرىدۇ ، نەتىجىدە ئېلېكتروفىللىق ۋە ئامىن تەكشۈرۈش ئەسۋابى يادروسى بىلەن تېخىمۇ ئىنكاس قايتۇرىدۇ.تەكشۈرۈش ئەسۋابى ئالكىن تۇتقۇچ بىلەن لايىھەلەنگەن بولۇپ ، خىمىيىلىك چېكىش ۋە LC / MS / MS خاراكتېرىنى تۆۋەنلىتىدۇ.
MiniSOG ئارقىلىق مۇرەسسە قىلىنغان ئاقسىلنىڭ مۇرەككەپلىكىنىڭ بەلگە خاراكتېرلىك تەسۋىرى.كۆك نۇرغا يولۇققاندا ، miniSOG-POI نى ئىپادىلەيدىغان ھۈجەيرىلەر يەككە ئوكسىگېن ھاسىل قىلىدۇ ، ئۇ ئۆز-ئارا تەسىر قىلىدىغان ئاقسىلنى ئۆزگەرتىدۇ ، ئەمما باغلانمايدىغان ئاقسىلنى ئۆزگەرتمەيدۇ.فوتو ئوكسىدلىنىشنىڭ ئوتتۇرا مەھسۇلاتلىرى ئامىن خىمىيىلىك تەكشۈرۈش ئەسۋابىنىڭ يەتكۈزۈش بەلگىسى ئارقىلىق توسۇلۇپ ، كوۋېنتال خۇرۇچ ھاسىل قىلىدۇ.خىمىيىلىك تەكشۈرۈش ئەسۋابىدىكى ئالكىن گۇرۇپپىسىنى چېكىش ئارقىلىق LC-MS / MS مىقدار ئارقىلىق چېكىش ئارقىلىق خىمىيىلىك ماددىلارنى بېيىتىشقا بولىدۇ.b ئامىن تەكشۈرۈش ئەسۋابىنىڭ خىمىيىلىك قۇرۇلمىسى 1-4.c خوندىرىئوسوملۇق يەرلىكلەشتۈرۈلگەن miniSOG ۋاسىتىلىك ئاقسىل بەلگىسىنىڭ ۋەكىل خاراكتېرلىك فلۇئورېسسېنسىيە گېلى ئانالىزى 1-4 تەكشۈرۈش ئەسۋابى ۋە گېلى زىچلىقىنى ئاساس قىلغان نىسپىي مىقدارنى ئىشلىتىش.خىمىيىلىك تەكشۈرۈشنىڭ سىگنال بىلەن تەگلىك نىسبىتى كۆك نۇرنى ئۆز ئىچىگە ئالمىغان ياكى HES293T ھۈجەيرىسىنى miniSOG ئىپادىلىمەي ئىشلىتىپ سەلبىي كونترول تەجرىبىسى ئارقىلىق باھالانغان.n = 2 بىئولوگىيىلىك مۇستەقىل ئەۋرىشكە.ھەر بىر چېكىت بىئولوگىيىلىك كۆپەيتىلگەن نۇسخىغا ۋەكىللىك قىلىدۇ.d PDPL نىڭ ۋەكىللىك بايقاش ۋە مىقدارلاشتۇرۇش ئەلالاشتۇرۇلغان تەكشۈرۈش 3 ئارقىلىق c غا ئوخشاش كۆرسىتىلگەن PDPL زاپچاسلىرىنىڭ بار ياكى يوقلۇقىدا.n = 3 بىئولوگىيىلىك مۇستەقىل ئەۋرىشكە.ھەر بىر چېكىت بىئولوگىيىلىك كۆپەيتىلگەن نۇسخىغا ۋەكىللىك قىلىدۇ.مەركىزى سىزىقچىلار ۋە پىچىرلاشلار ئوتتۇراھال ۋە ± ئۆلچەملىك ياتلىشىشنى كۆرسىتىدۇ.CBB: Coomassie Brilliant Blue.e يەككە قىزىل ئوكسىگېننىڭ قىزىل قىزىل Si-DMA داغلىرى بار.تارازىسى: 10 µm.گېلى تەسۋىر ھاسىل قىلىش ۋە ماس قەدەملىك تەجرىبە ئوخشاش نەتىجىگە ئېرىشكەندە كەم دېگەندە ئىككى قېتىم مۇستەقىل تەكرارلانغان.
بىز ئالدى بىلەن HEK293T دا مۇقىم ئىپادىلەنگەن پىشىپ يېتىلگەن فوتوسېنېرلاشتۇرغۇچ miniSOG26 ۋە KillerRed23 نىڭ ئىقتىدارىنى سىناق قىلىپ ، ئاقسىلنىڭ پروپراگلامىن ماركىسىنى خىمىيىلىك تەكشۈرۈش دەپ مۇرەسسە قىلدۇق (قوشۇمچە رەسىم 1a).گېلى فلۇئورېسسېنسىيە ئانالىزىدا كۆرسىتىلىشىچە ، پۈتۈن ئاقسىل بەلگىسى miniSOG ۋە كۆك نۇرنى نۇرلاندۇرۇش ئارقىلىق ئەمەلگە ئاشقان ، ئەمما KillerRed بىلەن كۆرۈنەرلىك بەلگە مەھسۇلاتلىرى كۆرۈلمىگەن.سىگنالنىڭ ئارقا كۆرۈنۈش نىسبىتىنى يۇقىرى كۆتۈرۈش ئۈچۈن ، ئاندىن ئانىلىن (1 ۋە 3) ، پروپىلامىن (2) ياكى بېنزېلامىن (4) بولغان بىر يۈرۈش خىمىيىلىك تەكشۈرۈشنى سىنىدۇق.بىز HEK293T ھۈجەيرىلىرىنىڭ ئۆزىدە كۆك نۇرغا سېلىشتۇرغاندا تېخىمۇ يۇقىرى تەگلىك سىگنالى بارلىقىنى بايقىدۇق ، بۇ بەلكىم ئىچكى مەنبەلىك رىبوفلاۋىن فوتوسىنتېزلاشتۇرغۇچ ، فلاۋىن مونۇكلېئوتىد (FMN) 27 بولۇشى مۇمكىن. ئانىلىننى ئاساس قىلغان خىمىيىلىك تەكشۈرۈش 1 ۋە 3 تېخىمۇ ياخشى ئېنىقلىق بەردى ، HEK293T خوندىرىئوسوملۇقتا miniSOG نى مۇقىم ئىپادىلەپ ، 3-تەكشۈرۈش ئەسۋابىنىڭ سىگنالىنىڭ 8 ھەسسە ئاشقانلىقىنى ، RNA بەلگىسى قويۇش ئۇسۇلىدا قوللىنىلغان CAP-seq نىڭ پەقەت 2 ~ 2 ~ 2 ~ 2 ~ 2 ~ 2 ~ 2 ~ 2 ~ 2 ~ 2 ~ 2 ~ 2 ~ 2 ~ 2 ~ 2 ~ قاتلىنىدىغان سىگنالنىڭ كۆپىيىشى ، RNA بىلەن ئاقسىلنىڭ ئوخشىمىغان ئاكتىپچانلىقى سەۋەبىدىن بولۇشى مۇمكىن (رەسىم 1b ، c). ئانىلىننى ئاساس قىلغان خىمىيىلىك تەكشۈرۈش 1 ۋە 3 تېخىمۇ ياخشى ئېنىقلىق بەردى ، HEK293T خوندىرىئوسوملۇقتا miniSOG نى مۇقىم ئىپادىلەپ ، 3-تەكشۈرۈش ئەسۋابىنىڭ سىگنالىنىڭ 8 ھەسسە ئاشقانلىقىنى ، RNA بەلگىسى قويۇش ئۇسۇلىدا قوللىنىلغان CAP-seq نىڭ پەقەت 2 ~ 2 ~ 2 ~ 2 ~ 2 ~ 2 ~ 2 ~ 2 ~ 2 ~ 2 ~ 2 ~ 2 ~ 2 ~ 2 ~ 2 ~ قاتلىنىدىغان سىگنالنىڭ كۆپىيىشى ، RNA بىلەن ئاقسىلنىڭ ئوخشىمىغان ئاكتىپچانلىقى سەۋەبىدىن بولۇشى مۇمكىن (رەسىم 1b ، c).ئانىلىننى ئاساس قىلغان خىمىيىلىك تەكشۈرۈش 1 ۋە 3 تېخىمۇ ياخشى ئالاھىدىلىكنى نامايان قىلدى: خوندىرىئوسوملۇقتا miniSOG نى مۇقىم ئىپادىلەيدىغان HEK293T ، 3-نومۇرلۇق تەكشۈرۈش سىگنالىنىڭ 8 ھەسسىدىن كۆپرەك ئاشقانلىقىنى كۆرسىتىپ بېرىدۇ ، 2-تەكشۈرۈش ئەسۋابى بولسا CAP-seq RNA بەلگە قويۇش ئۇسۇلىدا ئىشلىتىلىدۇ. ~ 2.5 ھەسسە سىگنالنىڭ ئېشىشىنى كۆرسىتىپ بېرىدۇ ، بەلكىم RNA بىلەن ئاقسىلنىڭ ئوخشىمىغان ئاكتىپچانلىقى سەۋەبىدىن بولۇشى مۇمكىن (رەسىم 1b ، c).基于 苯胺 的 化学 探针 1 和 3 具有 更好 的 特异性 HEK293T 在 线粒体 中 表达 表达 miniSOG ， 探针 3 的 信号 增加> 8 倍 ， 而 用于 RNA 标记 方法 CAP-seq 的 探针 2 仅 显示 ~ 2.5- 倍 信号 增加 ， 可能 由于 由于 RNA 和 蛋白质 之间 的 不同 反应 偏好 b 1b ， c）。I 苯胺 的 化学 探针 1 和 3 具有 更 的 特异性 ， hek293t - 倍 信号 增加 ， 可能 是 由于 RNAئانىلىننى ئاساس قىلغان خىمىيىلىك تەكشۈرۈش ئەسۋابىنىڭ 1 ۋە 3 نىڭ تېخىمۇ ياخشى ئالاھىدىلىكى بار ، HEK293T خوندىرىئوسوملۇقتا miniSOG نى مۇقىم ئىپادىلىدى ، 3-تەكشۈرۈش ئەسۋابىنىڭ سىگنالنىڭ 8 ھەسسىسىدىن ئېشىپ كەتتى ، CAP-seq RNA بەلگە قويۇش ئۇسۇلىنىڭ 2-تەكشۈرۈشى ئاران ~ 2.5 ھەسسە ئاشتى.سىگنالدا بەلكىم RNA بىلەن ئاقسىلنىڭ ئوخشىمىغان ئىنكاس مايىللىقى سەۋەبىدىن بولۇشى مۇمكىن (رەسىم 1b ، c).ئۇنىڭدىن باشقا ، تەكشۈرۈش ئەسۋابى 3 ئىزومېر ۋە گىدرازىن تەكشۈرۈش ئەسۋابى (5 ، 6 ، 7) تەكشۈرۈلۈپ ، 3-تەكشۈرۈش ئەسۋابىنىڭ ئەلالاشتۇرۇلغانلىقى ئىسپاتلاندى (قوشۇمچە رەسىم 1b ، c).ئوخشاشلا ، گېلىدىكى فلۇئورېسسېنسىيە ئانالىزىدا باشقا ئەلالاشتۇرۇلغان تەجرىبە پارامېتىرلىرى ئاشكارىلاندى: رادىئاتسىيە دولقۇنىنىڭ ئۇزۇنلۇقى (460 nm) ، خىمىيىلىك تەكشۈرۈشنىڭ قويۇقلۇقى (1 mM) ۋە نۇرلىنىش ۋاقتى (20 مىنۇت) (قوشۇمچە 2a - c).PDPL كېلىشىمىدىكى ھەر قانداق زاپچاس ياكى باسقۇچنى ئەمەلدىن قالدۇرۇش سىگنالنىڭ ئارقا سۇپىغا كۆرۈنەرلىك بۇرۇلۇشىنى كەلتۈرۈپ چىقاردى (رەسىم 1d).دىققەت قىلىشقا ئەرزىيدىغىنى ، يەككە ئوكسىگېننى ئۆچۈرۈۋېتىدىغانلىقى مەلۇم بولغان ناترىي ئازد ياكى ترولوكنىڭ ئالدىدا ئاقسىل بەلگىسى كۆرۈنەرلىك تۆۋەنلىگەن.يەككە ئوكسىگېننى مۇقىملاشتۇرىدىغانلىقى مەلۇم بولغان D2O نىڭ بارلىقى بەلگە سىگنالىنى كۈچەيتىدۇ.باشقا رېئاكسىيىلىك ئوكسىگېن تۈرلىرىنىڭ بەلگە سېلىشقا قوشقان تۆھپىسىنى تەكشۈرۈش ئۈچۈن ، ماننىتول ۋە ۋىتامىن C قوشۇلۇپ ، ئايرىم-ئايرىم ھالدا 18 ، 29 ، گىدروكسىل ۋە دەرىجىدىن تاشقىرى ئوكسىد رادىكال تازىلاش ماشىنىسى ئورنىتىلدى ، ئەمما ئۇلار بەلگىنى ئازايتىدىغانلىقى بايقالمىدى.H2O2 نى قوشقاندا ، ئەمما يورۇتۇلمىغان ، بەلگە چاپلىمىغان (قوشۇمچە 3a رەسىم).Si-DMA تەكشۈرۈش ئەسۋابى بىلەن فلۇئورېسسېنسىيە يەككە ئوكسىگېن تەسۋىر ھاسىل قىلىش HEK293T-miniSOG سىمىدا يەككە ئوكسىگېننىڭ بارلىقىنى دەلىللىدى ، ئەمما ئەسلىدىكى HEK293T سىمىدا يوق.بۇنىڭدىن باشقا ، mitoSOX Red يورۇتۇلغاندىن كېيىن دەرىجىدىن تاشقىرى ئوكسىد ئىشلەپچىقىرىشنى بايقىيالمىدى (1e رەسىم ۋە قوشۇمچە 3b رەسىم) 30. بۇ سانلىق مەلۇماتلار يەككە ئوكسىگېننىڭ كېيىنكى ئاقسىل بەلگىسىگە مەسئۇل ئاساسلىق ئاكتىپ ئوكسىگېن تۈرى ئىكەنلىكىنى كۈچلۈك كۆرسىتىپ بېرىدۇ.PDPL نىڭ Cytotoxicity كۆك نۇرنىڭ نۇرلىنىشى ۋە خىمىيىلىك تەكشۈرۈشنى ئۆز ئىچىگە ئالغان بولۇپ ، كۆرۈنەرلىك سىتاتسىك زەھەرلىنىش ئەھۋالى كۆرۈلمىگەن (قوشۇمچە 4a رەسىم).
بەلگە قويۇش مېخانىزمىنى تەتقىق قىلىش ۋە LC-MS / MS ئارقىلىق ئاقسىلنىڭ مۇرەككەپ ماددىلارنى ئاقسىل پەرقلەندۈرۈش ئىقتىدارىنى قوزغىتىش ئۈچۈن ، ئالدى بىلەن قايسى ئامىنو كىسلاتانىڭ ئۆزگەرتىلگەنلىكىنى ۋە تەكشۈرۈش بەلگىسىنىڭ دېلتا ماسسىسىنى ئېنىقلىشىمىز كېرەك.مېتونىن ، گىستودىن ، تىرىپتوفان ۋە تىروسىننىڭ يەككە ئوكسىگېن 14،15 تەرىپىدىن ئۆزگەرتىلگەنلىكى خەۋەر قىلىندى.بىز TOF-ABPP31 خىزمەت ئېقىمىنى MSFragger32 نى ئاساس قىلغان FragPipe ھېسابلاش سۇپىسى تەمىنلىگەن تەرەپسىز ئوچۇق ئىزدەش بىلەن بىرلەشتۈرىمىز.يەككە ئوكسىگېن ئۆزگەرتىش ۋە خىمىيىلىك تەكشۈرۈش بەلگىسى قويۇلغاندىن كېيىن ، چىكىش خىمىيىسىدە چىرىشچان ئۇلىنىش بار بولغان بىئوتىن كېمەيتىش بەلگىسى ئارقىلىق ئېلىپ بېرىلدى ، ئاندىن نېيتراۋىدىن سوزۇلدى ۋە تىرىپسىن ھەزىم قىلىندى.ئۆزگەرتىلگەن پېپتىد يەنىلا قالدۇققا باغلانغان بولۇپ ، LC-MS / MS تەھلىلى ئۈچۈن كۆپەيتىلگەن (2a رەسىم ۋە قوشۇمچە سانلىق مەلۇمات 1).50 دىن ئارتۇق پېپتىد خەرىتىسى (PSM) ماسلاشتۇرۇلغان بارلىق ئاقسىلدا نۇرغۇن ئۆزگىرىشلەر يۈز بەردى (2b رەسىم).ھەيران قالارلىقى ، بىز پەقەت گىستودىننىڭ ئۆزگىرىشىنىلا كۆزىتتۇق ، بەلكىم ئوكسىدلانغان گىستودىننىڭ ئانىلىن تەكشۈرۈشىگە بولغان ئاكتىپچانلىقى باشقا ئامىنو كىسلاتاغا قارىغاندا يۇقىرى بولۇشى مۇمكىن.يەككە ئوكسىگېن ئارقىلىق ئېلان قىلىنغان گىستودىن ئوكسىدلىنىش مېخانىزىمىغا ئاساسەن ، +229 Da نىڭ ئوتتۇرىغا قويۇلغان دېلتا ماسسىسى قۇرۇلمىسى 21،33 بولۇپ ، ئىككى ئوكسىدلانغاندىن كېيىن 2 ئوكسىدلىق گىستودىن بىلەن تەكشۈرۈش ئەسۋابىنىڭ قوشۇلۇشىغا ماس كېلىدۇ ، +247 Da بولسا گىدرولىز مەھسۇلات. +229 Da (قوشۇمچە 5-رەسىم).MS2 سپېكترىنى باھالاشتا كۆپ قىسىم y ۋە b ئىئونلىرىنى پەرقلەندۈرۈشنىڭ ئىشەنچلىكلىكى يۇقىرى بولۇپ ، ئۆزگەرتىلگەن بۆلەك ئىئونلىرىنى پەرقلەندۈرۈش (y ۋە b) (رەسىم 2c).PDPL ئۆزگەرتىلگەن گىستودىننىڭ يەرلىك تەرتىپىنى مەزمۇن ئانالىزىدا ± 1 ئورۇندىكى كىچىك گىدروپوبىك قالدۇقلىرىنىڭ ئوتتۇراھال نەقىش مايىللىقى ئاشكارىلاندى (قوشۇمچە 4b رەسىم).ئوتتۇرا ھېساب بىلەن ھەر بىر ئاقسىلدا 1.4 گىستودىن ئېنىقلانغان بولۇپ ، بۇ بەلگىلەرنىڭ ئورۇنلىرى ئېرىتكىلى بولىدىغان يەر يۈزى (SASA) ۋە نىسپىي ئېرىتىشچانلىقى (RSA) ئانالىزى ئارقىلىق بېكىتىلگەن (قوشۇمچە رەسىم 4c ، d).
MSFragger تەمىنلىگەن FragPipe ھېسابلاش سۇپىسى ئارقىلىق قالدۇق تاللاشنى تەتقىق قىلىدىغان بىر تەرەپسىز خىزمەت ئېقىمى.سۈزگۈچ ئۇلىغۇچ چېكىش خىمىيىسىدە ئىشلىتىلىدۇ ، سترېپتاۋىدىن قالدۇقىدىن ئۆزگەرتىلگەن پېپتىدلارنىڭ رەسىمگە تارتىلىشىغا يول قويىدۇ.نۇرغۇن ئۆزگەرتىشلەرنى ، شۇنداقلا مۇناسىۋەتلىك قالدۇقلارنى ئېنىقلاش ئۈچۈن ئوچۇق ئىزدەش باشلاندى.b ئاقسىلدا يۈز بەرگەن ئۆزگەرتىشلەرنىڭ ماسسىسىنى بەلگىلەڭ.پېپتىد خەرىتىسى PSM.c تەكشۈرۈش ئەسۋابى بىلەن ئۆزگەرتىلگەن گىستودىن تور بېكەتلىرىنىڭ MS2 سپېكتېل ئىزاھاتى 3. ۋەكىللىك مىسال سۈپىتىدە ، 3-نومۇرلۇق تەكشۈرۈش ئەسۋابىنىڭ تەڭكەش ئىنكاسى ئۆزگەرتىلگەن ئامىنو كىسلاتاغا +229.0938 Da قوشۇلدى.d PDPL بەلگىسىنى سىناشتا ئىشلىتىلىدىغان Mutation Assay.PRDX3 (H155A, H225A) ۋە PRDX1 (H10A, H81A, H169A) بايراققا قارشى بايقاش ئۈچۈن ياۋا تىپتىكى پىلازمىلار بىلەن ئالماشتۇرۇلدى.e بىرىكمە پېپتىد 3-تەكشۈرۈش ئەسۋابى ئالدىدا ساپلاشتۇرۇلغان miniSOG بىلەن رېئاكسىيە قىلىندى ، LC-MS سپېكترىدا Δm +247 ۋە +229 بولغان ماس مەھسۇلاتلار كۆرسىتىلدى.f مىكرو ئاقسىل بىلەن ئاقسىلنىڭ ئۆز-ئارا تەسىر قىلىشىدا miniSOG-6xHis بەلگىسى ۋە 6xHis ئانتىتېلاسى مودېل قىلىنغان.ئانتىبىئوتىن (streptavidin-HRP) ۋە چاشقانغا قارشى غەربنىڭ blot تەھلىلى ، نۇرنىڭ يورۇتۇش ۋاقتىغا ئاساسەن ، تەكشۈرۈش ئەسۋابى 3 دەپ بەلگە قويۇلغان miniSOG-6xHis / 6xHis غا قارشى ئانتىتېلا مۇرەككەپ ماددىسىنى ئانالىز قىلدى.يەككە ئاقسىلنىڭ بەلگىسى مۇناسىپ مولېكۇلا ئېغىرلىقىدا ئىپادىلىنىدۇ: LC ئانتىتېلا نۇر زەنجىرى ، HC ئانتىتېلاسى ئېغىر زەنجىرى.بۇ سىناقلار مۇشۇنىڭغا ئوخشاش نەتىجىلەر بىلەن كەم دېگەندە ئىككى قېتىم مۇستەقىل تەكرارلاندى.
بەلگە ئورنىنىڭ بىئو-خىمىيىلىك تەكشۈرۈشى ئۈچۈن ، ئاممىۋى سپېكترى ئارقىلىق ئېنىقلانغان PRDX3 ۋە PRDX1 گىستودىندىن ئالانىنغا ئۆزگەرتىلىپ ، يۇقۇملىنىش تەكشۈرۈشىدىكى ياۋا تىپقا سېلىشتۇرغاندا.PDPL نەتىجىسى شۇنى ئىسپاتلىدىكى ، ئۆزگىرىش بەلگىسى كۆرۈنەرلىك تۆۋەنلىگەن (2d رەسىم).شۇنىڭ بىلەن بىر ۋاقىتتا ، ئوچۇق ئىزدەشتە ئېنىقلانغان پېپتىد تەرتىپلىرى 3-نومۇرلۇق تەكشۈرۈش ئەسۋابى ۋە كۆك نۇر ئالدىدا ساپلاشتۇرۇلغان miniSOG بىلەن بىرىكتۈرۈلۈپ ئىنكاس قايتۇرۇلغان بولۇپ ، LC-MS تەرىپىدىن بايقىغاندا كەڭ كۆلەمدە +247 ۋە +229 Da بولغان مەھسۇلات ئىشلەپچىقىرىلىدۇ (رەسىم) 2e).).MiniSOG فوتوئاكتىپلىق ئىنكاسىغا ئاساسەن يېقىن ئاقسىلنىڭ ئۆز-ئارا تەسىر كۆرسىتىشى مۇمكىنلىكىنى سىناش ئۈچۈن ، بىز miniSOG-6xHis ئاقسىلى بىلەن ئۇنىڭ ۋىرۇسقا قارشى ئانتىتېلانىڭ ئۆز-ئارا تەسىر قىلىشى ئارقىلىق سۈنئىي يېقىن ئارىلىقنى لايىھىلەپ چىقتۇق (2f رەسىم).بۇ ماقالىدە ، بىز miniSOG بىلەن ئانتىتېلا ئېغىر ۋە يېنىك زەنجىرنىڭ يېقىن بەلگىسىنى مۆلچەرلىدۇق.ئەمەلىيەتتە ، چاشقانغا قارشى تۇرۇش (6xHis ماركىسىدىكى ئانتىتېلانىڭ ئېغىر ۋە يېنىك زەنجىرىنى تونۇش) ۋە سترېپتاۋىدىن غەرب توپىدا ئېغىر ۋە يېنىك زەنجىرنىڭ كۈچلۈك بىئوتىن بىرىكتۈرۈلگەنلىكى كۆرسىتىلدى.تىلغا ئېلىشقا ئەرزىيدىغىنى ، بىز 6xHis بەلگىسى ۋە يېنىك ۋە ئېغىر زەنجىرنىڭ ئۆز-ئارا ئۇلىنىشى سەۋەبىدىن miniSOG ئاپتوماتىك تەرجىمىگە دىققەت قىلدۇق ، بۇ بەلكىم لىزېن بىلەن 2-ئوكسىد-گىستودىننىڭ يېقىن ئىنكاسىنىڭ پەرقى بىلەن مۇناسىۋەتلىك بولۇشى مۇمكىن.خۇلاسە شۇكى ، PDPL يېقىن ئارىلىققا تايىنىدىغان ئۇسۇلدا ھىدنىدنى ئۆزگەرتىدۇ.
بىزنىڭ كېيىنكى مەقسىتىمىز تارماق بەلگە خاراكتېرلىك ئاقسىلنى سۈپەتلەپ ، بەلگە ئورنىتىشنىڭ كونكرېتلىقىنى سىناش.شۇڭلاشقا ، بىز HEK293T ھۈجەيرىسىنىڭ يادروسى ، خوندىرىئوسوملۇق ماترىسسا ياكى تاشقى ER پەردىسىدە miniSOG نى مۇقىم ئىپادىلىدۇق (3a رەسىم).گېلى فلۇئورېسسېنسىيە ئانالىزىدا ئۈچ تارماق ئورۇندىكى مول بەلگە بەلۋاغلىرى ۋە ئوخشىمىغان بەلگە ئەندىزىسى ئاشكارىلاندى (3b رەسىم).فلۇئورېسسېنسىيە تەسۋىر ھاسىل قىلىش ئانالىزى PDPL نىڭ يۇقىرى ئالاھىدىلىكىنى كۆرسىتىپ بەردى (3c رەسىم).PDPL خىزمەت ئېقىمى رودامىن بوياقلىرى بىلەن چېكىش رېئاكسىيەسىدىن كېيىن ، فلۇئورېسسېنسېنلىق مىكروسكوپ ئارقىلىق تارماق ھۈجەيرە ئاقسىلىنى ئېنىقلاپ چىقتى ، PDPL سىگنالى DAPI ، خوندىرىئوسوملۇق ئىز قوغلاش ماشىنىسى ياكى ER ئىز قوغلاش ماشىنىسى بىلەن بىرىكتۈرۈلۈپ ، PDPL نىڭ يۇقىرى سادىقلىقىنى ئىسپاتلىدى.ئۈچ ئورگانىك ئورۇنغا نىسبەتەن ، PDPL نى TurboID بىلەن avidin غەرب توپى ئىشلىتىپ بىرمۇبىر سېلىشتۇرۇش PDPL نىڭ كونتروللۇقىغا سېلىشتۇرغاندا تېخىمۇ ئالاھىدە بەلگە قويۇلغانلىقىنى كۆرسەتتى.PDPL شارائىتىدا تېخىمۇ كۆپ بەلگە قويۇلغان بەلۋاغلار پەيدا بولۇپ ، تېخىمۇ كۆپ PDPL ماركىلىق ئاقسىلنى كۆرسىتىدۇ (قوشۇمچە 6a-d).
miniSOG ۋاسىتىلىك ئورگانىك ئالاھىدە ئاقسىل بەلگىسىنىڭ سىخېمالىق ئىپادىلىنىشى.miniSOG خوندىرىئوسوملۇق ماترىسسانى بىرىكتۈرۈش ئارقىلىق ئىنسانلارنىڭ COX4 (mito-miniSOG) نىڭ N تېرمىنالىغا 23 ئامىنو كىسلاتاغا ، بىرىكتۈرۈش ئارقىلىق يادرو H2B (يادرو- miniSOG) غا ، Sec61β بولسا ER پەردىسىنىڭ سىپوپلازما تەرىپىگە (ER-miniSOG) نىشان قىلىدۇ. ).كۆرسەتكۈچ گېلى تەسۋىر ھاسىل قىلىش ، ماس قەدەملىك تەسۋىر ھاسىل قىلىش ۋە ئاممىۋى سپېكترى قاتارلىقلارنى ئۆز ئىچىگە ئالىدۇ.b ئۈچ خىل ئورگانىك ئالاھىدە PDPL ئارخىپىنىڭ ۋەكىللىك گېلى رەسىملىرى.CBB Coomassie پارلاق كۆك.c HEK293T ھۈجەيرىسىنىڭ ۋەكىللىك ماسلاشتۇرۇلغان رەسىملىرى V5 (قىزىل) دەپ يېزىلغان ئانتىتېلا تەرىپىدىن بايقالغان ئوخشىمىغان تارماق ھۈجەيرە يەرلىكلەشتۈرۈلگەن miniSOG نى مۇقىم ئىپادىلەيدۇ.خوندىرىئوسوم ۋە ER (يېشىل) ئۈچۈن تارماق بەلگە ئىشلىتىلىدۇ.PDPL خىزمەت ئېقىمى Cy3-azide چېكىش خىمىيىسى ئارقىلىق miniSOG (سېرىق) بەلگىسى بار تارماق ھۈجەيرە ئاقسىلىنى بايقاشنى ئۆز ئىچىگە ئالىدۇ.تارازىسى: 10 µm.d PDPL بەلگىسىدىكى ئاقسىللارنىڭ ھەر خىل ئورگانىزملاردىكى بەلگە خاراكتېرلىك مىقدارلاشتۇرۇلۇشى (n = 3 مۇستەقىل بىئولوگىيىلىك تەجرىبە) ئارقىلىق مىقدارلاشقان.ئىككى قۇيرۇقلۇق ئوقۇغۇچىلارنىڭ T سىنىقى يانار تاغ مەيدانلىرىدا ئىشلىتىلگەن.HEK293T ياۋا تىپ پاسسىپ كونترول سۈپىتىدە ئىشلىتىلگەن. كۆرۈنەرلىك ئۆزگەرتىلگەن ئاقسىل قىزىل رەڭدە گەۋدىلىنىدۇ (p <0.05 ۋە> 2 ھەسسە ئىئون كۈچلۈكلۈك پەرقى). كۆرۈنەرلىك ئۆزگەرتىلگەن ئاقسىل قىزىل رەڭدە گەۋدىلىنىدۇ (p <0.05 ۋە> 2 ھەسسە ئىئون كۈچلۈكلۈك پەرقى). Значительно измененные белki выделены красным цветом (p <0,05 и> 2-кратная разница в интингности ионов). كۆرۈنەرلىك ئۆزگەرتىلگەن ئاقسىل قىزىل رەڭدە گەۋدىلىنىدۇ (p <0.05 ۋە> ئىئوننىڭ كۈچلۈكلۈكىدىكى 2 ھەسسە پەرق).<着 变化 的 蛋白质 以 红色 <<p <0.05 和> 2 倍 离子 强度 差异）。显 着 变化 的 蛋白质 以 红色 <（p <0.05 和> 2 Значительно измененные белki выделены красным цветом (p <0,05 и> 2-кратная разница в ионной силе). كۆرۈنەرلىك ئۆزگەرتىلگەن ئاقسىل قىزىل رەڭدە گەۋدىلىنىدۇ (p <0.05 ۋە> ئىئون كۈچىنىڭ 2 ھەسسىلىك پەرقى).HEK293T-miniSOG ئۈچۈن مۇھىم ، ئەمما HEK293T ئۈچۈن مۇھىم بولمىغان ئاقسىللار يېشىل رەڭدە كۆرسىتىلدى.e تەجرىبە سانلىق مەلۇمات سانلىق مەلۇماتلىرىنىڭ كونكرېتلىقىنى تەھلىل قىلىش d.ھەر بىر ئورگانىك (قىزىل ۋە يېشىل چېكىت) دىكى ستاتىستىكىلىق ئەھمىيەتلىك ئاقسىلنىڭ ئومۇمىي سانى يۇقىرىغا بەلگە قويۇلغان.گىستوگراممىدا MitoCarta 3.0 ، GO تەھلىلى ۋە A. تىڭ قاتارلىقلار ئاساس قىلىنغان ئورگانىكلاردا يەرلىك ئاقسىل كۆرسىتىلدى.كىشىلەر.خوندىرىئوسوم ، يادرو ۋە ER ئۈچۈن ئايرىم سانلىق مەلۇمات جەدۋىلى.بۇ سىناقلار مۇشۇنىڭغا ئوخشاش نەتىجىلەر بىلەن كەم دېگەندە ئىككى قېتىم مۇستەقىل تەكرارلاندى.خام سانلىق مەلۇمات خام ماتېرىيال ھۆججىتى شەكلىدە تەمىنلەنگەن.
گېلى ۋە تەسۋىر ھاسىل قىلىش نەتىجىسىنىڭ تۈرتكىسىدە ، بەلگەسىز مىقدارلاشتۇرۇش ئارقىلىق ھەر بىر ئورگاندىكى بايقالغان ئاقسىلنى مىقدارلاشتۇرۇشقا ئىشلىتىلىدۇ (قوشۇمچە سانلىق مەلۇمات 2).تەكشۈرۈلمىگەن HEK293T تەگلىك بەلگىسىنى ئېلىشتا پاسسىپ كونترول سۈپىتىدە ئىشلىتىلگەن. يانار تاغ سىيۇژىتى ئانالىزىدا كۆرۈنەرلىك موللانغان ئاقسىللار (p <0.05 ۋە> 2 ھەسسە ئىئوننىڭ كۈچلۈكلۈكى) شۇنداقلا پەقەت miniSOG ئىپادىلەش لىنىيىسىدىلا بار بولغان يەككە ئاقسىل (3d رەسىم قىزىل ۋە يېشىل چېكىت) كۆرسىتىلدى. يانار تاغ سىيۇژىتى ئانالىزىدا كۆرۈنەرلىك موللانغان ئاقسىللار (p <0.05 ۋە> 2 ھەسسە ئىئوننىڭ كۈچلۈكلۈكى) شۇنداقلا پەقەت miniSOG ئىپادىلەش لىنىيىسىدىلا بار بولغان يەككە ئاقسىل (3d رەسىم قىزىل ۋە يېشىل چېكىت) كۆرسىتىلدى. ئانانىكا گراكاكا ۋۇلكانا پوكازال значительно обогщенные белки (p <0, 05 и> 2-кратная интингность ионов), а takже одиночные белki, кот че присутствуют только в вияхх, рисе рис. يانار تاغ سىيۇژىتى ئانالىزىدا كۆرۈنەرلىك موللانغان ئاقسىللار (p <0.05 ۋە> 2 ھەسسە ئىئوننىڭ كۈچلۈكلۈكى) شۇنداقلا پەقەت miniSOG ئىپادىلەش لىنىيىسىدىلا بار بولغان ئاقسىللار كۆرسىتىلدى (3d رەسىم ، قىزىل ۋە يېشىل چېكىتلەر).火山 图 分析 显示 出 显 <<<p <0.05 和> 2 倍 离子 强度） 在于 在于 miniSOG 表达 系 中 的 单一 d d 3d 红色 和 绿色 点）。。火山 图 分析 显示 出 着 <<p <0.05 和> 2 倍 离子 强度） 在于 在于 minisog 表达 系 的 单一 d 图 d 3d 红色 绿色 点）））））） ئانازانىكاكا ۋۇلكانا - ۋىزۋىل значительно обощенные белки (p <0, 05 и> 2x ионная сила), а takже отдельнее белки, присутствующие только врезрес чиной чии miniSOG (красные и зеленые точки). يانار تاغ سىيۇژىتى ئانالىزىدا كۆرۈنەرلىك موللانغان ئاقسىللار (p <0.05 ۋە> 2x ئىئون كۈچى) شۇنداقلا miniSOG ئىپادىلەش لىنىيىسىدە بار بولغان يەككە ئاقسىللار (3d رەسىمدىكى قىزىل ۋە يېشىل چېكىتلەر) ئاشكارىلاندى.بۇ سانلىق مەلۇماتلارنى بىرلەشتۈرگەندە ، بىز ئايرىم-ئايرىم ھالدا 1364 ، 461 ۋە 911 ستاتىستىكىلىق ئەھمىيەتكە ئىگە يادرو ، خوندىرىئوسوملۇق ۋە ER تاشقى پەردە ئاقسىلىنى ئېنىقلىدۇق.ئورگانىك يەرلىكلەشتۈرۈلگەن PDPL نىڭ توغرىلىقىنى تەھلىل قىلىش ئۈچۈن ، بىز MitoCarta 3.0 ، گېن ئونتولوگىيەسى (GO) تەھلىلى ۋە A. تىڭ قاتارلىقلار.خوندىرىئوسوم ، يادرو ۋە ER ئۈچۈن بايقالغان بىر سانلىق مەلۇمات بايقالغان ئاقسىلنىڭ ئورگانىك ئالاھىدىلىكىنى سىناش ئۈچۈن ئىشلىتىلگەن بولۇپ ، توغرىلىق نىسبىتى 73.4 ، 78.5 ۋە% 73.0 (3e رەسىم).PDPL نىڭ ئالاھىدىلىكى PDPL نىڭ ئورگانىك ئاقسىلنى پەرقلەندۈرۈشتىكى كۆڭۈلدىكىدەك قورال ئىكەنلىكىنى ئىسپاتلايدۇ.دىققەت قىلىشقا ئەرزىيدىغىنى ، ئېنىقلانغان خوندىرىئوسوملۇق ئاقسىلنىڭ بويۇن ئومۇرتقىسى ئانالىزىدا كۆرسىتىلىشىچە ، قاپسىلىپ قالغان ئاقسىل ئاساسلىقى ماترىسسا ۋە ئىچكى پەردىدە (ئايرىم-ئايرىم ھالدا 226 ۋە 106) تارقىتىلغان بولۇپ ، ئېنىقلانغان خوندىرىئوسوملۇق ئاقسىلنىڭ ئومۇمىي سانىنىڭ% 91.7 (362) نى ئىگىلەيدىكەن.يۇقىرى دەرىجىدىكى PDPL قوشۇمچە دەلىللەندى (قوشۇمچە 7a رەسىم).ئوخشاشلا ، يەر ئاستى يادرو ئانالىزىدا تۇتۇلغان ئاقسىلنىڭ ئاساسلىقى يادرو ، يادرو ۋە يادرودا تارقىلىدىغانلىقى كۆرسىتىلدى (قوشۇمچە 7b رەسىم).يادرو يەرلىكلەشتۈرۈش سىگنالى پېپتىد (3xNLS) بىلەن يادرو ئاقسىلى ئانالىزى H2B قۇرۇلمىسىغا ئوخشاش توغرىلىقنى كۆرسەتتى (قوشۇمچە رەسىم 7c - h).PDPL بەلگىسىنىڭ كونكرېتلىقىنى ئېنىقلاش ئۈچۈن ، يادرو لامىنېن A تېخىمۇ ئېنىق يەرلىكلەشتۈرۈلگەن POI7 توزىقى قىلىپ تاللاندى.PDPL كۆرۈنەرلىك دەرىجىدە موللانغان 36 خىل ئاقسىلنى ئېنىقلاپ چىقتى ، بۇنىڭ ئىچىدە 12 خىل ئاقسىل (لامىن A نى ئۆز ئىچىگە ئالىدۇ% 30.0) ياخشى خاراكتېرگە ئىگە لامىن A بولۇپ ، String سانلىق مەلۇمات ئامبىرى تەرىپىدىن ئىزاھلانغان ئۆز-ئارا تەسىر كۆرسىتىدىغان ئاقسىل بولۇپ ، BioID ئۇسۇلى (122 ئاقسىل) نىڭ 28 ، 22.9 نىڭ 28 دىن يۇقىرى. %) 7. بىزنىڭ ئۇسۇلىمىز ئاقسىلنىڭ ئازلىقىنى ئېنىقلاپ چىقتى ، بۇ بەلكىم بەلگە قويۇلغان رايونلارنىڭ سەۋەبىدىن بولۇشى مۇمكىن ، بۇ تېخىمۇ ئاكتىپ يەككە ئوكسىگېن ئارقىلىق بارلىققا كەلگەن.GO تەھلىلىدە كۆرسىتىلىشىچە ، بايقالغان ئاقسىللار ئاساسلىقى يادرو (26) ، يادرو پەردىسى (10) ، يادرو پەردىسى (9) ۋە يادرو تۆشۈكچىلىرى (5) گە جايلاشقان.يىغىپ ئېيتقاندا ، بۇ يادرو يەرلىكلەشتۈرۈلگەن ئاقسىللار موللانغان ئاقسىلنىڭ% 80 نى ئىگىلەپ ، PDPL نىڭ ئالاھىدىلىكىنى تېخىمۇ نامايان قىلدى (قوشۇمچە 8a - d).
PDPL نىڭ ئورگانىكلاردا يېقىنلىق بەلگىسىنى ئىجرا قىلىش ئىقتىدارىنى تۇرغۇزغاندىن كېيىن ، ئاندىن PDPL نىڭ POI باغلاش شېرىكلىرىنى تەھلىل قىلىشقا ئىشلىتىلىدىغان ياكى بولمايدىغانلىقىنى سىنىدۇق.بولۇپمۇ بىز PDPL سىتوسول ئاقسىلىنى ئانالىز قىلىشقا ئېنىقلىما بەردۇق ، ئۇلارنىڭ ھەرىكەتچانلىقى كۈچلۈك بولغاچقا ، ئۇلارنىڭ پەردىسى يەرلىكلەشتۈرۈلگەن كەسىپداشلىرىغا قارىغاندا تېخىمۇ قىيىن نىشان دەپ قارىلىدۇ.برومودومېن ۋە تاشقى ھۈجەيرە (BET) ئاقسىلى BRD4 ئۇنىڭ 35 ، 36 خىل كېسەللىكلەرنىڭ مۇھىم رولى بىلەن دىققىتىمىزنى تارتتى.BRD4 شەكىللەندۈرگەن مۇرەككەپ تىرانسكرىپسىيە ئاكتىپلاشتۇرغۇچ ۋە مۇھىم داۋالاش نىشانى.C-myc ۋە Wnt5a ترانسكرىپسىيە ئامىلىنىڭ ئىپادىلىنىشىنى تەڭشەش ئارقىلىق ، BRD4 ئۆتكۈر مېيلوئىد ئاق قان كېسىلى (AML) ، كۆپ خىل يىراقنى كۆرەلمەسلىك كېسەللىكى ، بۇركىت لىمفا ئۆسمىسى ، ئۈچەي راكى ۋە ياللۇغلىنىش كېسەللىكلىرىنىڭ مۇھىم بەلگىلىگۈچىسى دەپ قارىلىدۇ.ئۇنىڭدىن باشقا ، بەزى ۋىرۇسلار BRD4 نى نىشانلاپ ۋىرۇس ۋە ھۈجەيرە تىرانسپورتىنى تەڭشەيدۇ ، مەسىلەن papillomavirus ، HIV ۋە SARS-CoV-236,39.
PDPL ئارقىلىق BRD4 ئۆز-ئارا تەسىر كۆرسىتىش خەرىتىسىنى سىزىش ئۈچۈن ، بىز miniSOG بىلەن BRD4 نىڭ قىسقا N ياكى C تېرمىنال ئىزفورمىسىنى بىرلەشتۈردۇق.ئاقسىل نەتىجىسى ئىككى قۇرۇلۇشنىڭ يۇقىرى دەرىجىدىكى بىر-بىرىنى قاپلىغانلىقىنى ئاشكارىلىدى (قوشۇمچە 9a رەسىم).MiniSOG-H2B بىلەن ئېنىقلانغان يادرو ئاقسىلى BRD4 بىلەن ئۆز-ئارا تەسىر كۆرسىتىدىغان ئاقسىلنىڭ% 77.6 نى ئۆز ئىچىگە ئالىدۇ (قوشۇمچە رەسىم 9b).ئاندىن ، ئوخشىمىغان يورۇتۇش ۋاقىتلىرى (2 ، 5 ، 10 ، 20 مىنۇت) بەلگە رادىئوسىنى تەڭشەش ئۈچۈن ئىشلىتىلدى (4a رەسىم ۋە قوشۇمچە سانلىق مەلۇمات 3).بىز خۇلاسە چىقىرىمىزكى ، قىسقا فوتوئاپپاراتتا ، PDPL ئاساسلىقى بىۋاسىتە باغلىنىشلىق شېرىكلەرگە بەلگە قويىدۇ ، ئۇزۇن مەزگىل بولسا قىسقا سۈرەتكە تارتىش مەزگىلىدە بايقالغان ئاقسىل شۇنداقلا بەلگە توپلاشتىكى ۋاسىتىلىك نىشاننى ئۆز ئىچىگە ئالىدۇ.ئەمەلىيەتتە ، بىز قوشنا ۋاقىت نۇقتىلىرى (84.6% 2 ۋە 5 مىنۇت; 87.7% 5 ۋە 10 مىنۇت;بارلىق تەجرىبە گۇرۇپپىلىرىدا ، بىز BRD4 نىڭ ئۆزىگە بەلگە چاپلاپلا قالماي ، يەنە سانداندا ئىزاھلانغان MED1 ، CHD8 ، BICRA ، NIPBL ، SMC1A ۋە HMGB1 قاتارلىق بىر قانچە داڭلىق نىشانلارنى بايقىدۇق.بۇ نىشانلارنىڭ ئىئون كۈچى ئاشكارلىنىش ۋاقتىغا ماس كېلىدۇ (4c رەسىم ۋە قوشۇمچە 9d رەسىم).GO 2 مىنۇتلۇق گۇرۇپپىدا بايقالغان ئاقسىللارنى ئانالىز قىلغاندا ، بايقالغان ئاقسىلنىڭ يادرودا يەرلىكلەشتۈرۈلگەنلىكى ۋە خرومتىننى ئۆزگەرتىش ۋە RNA پولىمېرازا ئىقتىدارىغا قاتناشقانلىقى كۆرسىتىلدى.ئاقسىلنىڭ مولېكۇلا ئىقتىدارى BRD4 ئىقتىدارىغا ماس كېلىدىغان خرومتىن باغلاش ياكى ترانسكرىپسىيەلىك ئۆز-ئارا ماسلىشىشتا بېيىغان (4d رەسىم).سانلىق مەلۇمات ئامبىرى قوزغىتىلغان ئاقسىل ئۆز-ئارا تەسىر ئانالىزىدا BRD4 ۋە HDAC ئائىلىسىنىڭ SIN3A ، NCOR2 ، BCOR ۋە SAP130 (4e رەسىم ۋە قوشۇمچە 9e رەسىم) ئۆز-ئارا تەسىر كۆرسىتىدىغان مۇرەككەپ ئۆز-ئارا تەسىر كۆرسىتىشى ئاشكارىلاندى ، بۇ BRD4 ۋە HDAC باغلىنىشلىق ئاتسېتىللانغان تارىخقا ماس كېلىدۇ. ..بۇنىڭدىن باشقا ، LC-MS / MS تەرىپىدىن ئېنىقلانغان Sin3A ، NSUN2 ، Fus ۋە SFPQ قاتارلىق ۋەكىللىك نىشانلار غەربنىڭ پارچىلىنىشى بىلەن ئىسپاتلاندى (4f رەسىم).يېقىندا ، BRD4 نىڭ قىسقا ئىزفورم سۇيۇق سۇيۇقلۇق فازا ئايرىش (LLPS) خۇسۇسىيىتى بىلەن يادرو ھاسىل قىلىدىغانلىقى خەۋەر قىلىندى.RNA باغلاش ئاقسىلى Fus ۋە SFPQ ھەر خىل ھۈجەيرە جەريانىدىكى LLPS نى ۋاسىتە قىلىدۇ ۋە بۇ يەردە خاتىرىلەنمىگەن BRD4 باغلاش ئاقسىلى دەپ بېكىتىلدى.BRD4 بىلەن SFPQ نىڭ ئۆز-ئارا تەسىر قىلىشى ئورتاق ئىممۇنىتېتلاش (ئورتاق IP) تەجرىبىسى ئارقىلىق ئىسپاتلاندى (4g رەسىم) ، بۇ BRD4 ۋاسىتىلىك سۇيۇقلۇق-سۇيۇقلۇق باسقۇچنى ئايرىشنىڭ يەنىمۇ ئىلگىرىلىگەن ھالدا تەكشۈرۈشكە ئەرزىيدىغان مېخانىزمىنى ئوتتۇرىغا قويدى.ئومۇملاشتۇرغاندا ، بۇ نەتىجىلەر PDPL نىڭ BRD4 نىڭ ئۆز-ئارا تەسىر كۆرسىتىشى شۇنداقلا نامەلۇم باغلاش ئاقسىلىنى پەرقلەندۈرۈشتىكى كۆڭۈلدىكىدەك سۇپا ئىكەنلىكىنى كۆرسىتىپ بېرىدۇ.
miniSOG ۋاسىتىلىك BRD4 يېقىنلىق بەلگىسىنىڭ سىخېمالىق ئىپادىلىنىشى ، ئاشكارلىنىش ۋاقتى: 2 ، 5 ، 10 ۋە 20 مىنۇت.b ئوخشىمىغان يورۇتۇش ۋاقىتلىرىدا بايقالغان ئاقسىللارنىڭ قاپلىنىشى.HEK293T-miniSOG-BRD4 دا ئېنىقلانغان ئاقسىلنىڭ موللىنىشى ياۋا تىپتىكى HEK293T غا سېلىشتۇرغاندا ستاتىستىكىلىق ئەھمىيەتكە ئىگە.c بەلگىلىك ئاشكارلانغان ۋاقىتتا بەلگە قويۇلغان BRD4 باغلاشچان ئاقسىلنى ئېنىقلىغاندا ۋەكىلنىڭ كۈچلۈكلۈكى.n = 3 بىئولوگىيىلىك مۇستەقىل ئەۋرىشكە.سانلىق مەلۇماتلار ئوتتۇراھال ± ئۆلچەملىك ياتلىشىش شەكلىدە كۆرسىتىلدى.d 2 مىنۇتلۇق گۇرۇپپىدا ئېنىقلانغان ئاقسىلنىڭ گېن ئونتولوگىيەلىك ئانالىزى (GO).ئالدىنقى ئون GO شەرتى تىزىلغان.كۆپۈكچىلەر GO ئاتالغۇ تۈرىگە ئاساسەن رەڭلىك بولىدۇ ، كۆپۈكنىڭ چوڭلۇقى ھەر بىر ئاتالغۇدا بايقالغان ئاقسىلنىڭ سانىغا ماس كېلىدۇ.e ئاقسىلنىڭ BRD4 بىلەن ئۆز-ئارا تەسىر كۆرسىتىشىنى تىزگىنلەش.سېرىق چەمبىرەك بىۋاسىتە يېلىم ، كۈلرەڭ چەمبەر بولسا ۋاسىتىلىك يېلىمنىڭ بىرىنچى قەۋىتى.قىزىل سىزىقلار تەجرىبە ئارقىلىق بېكىتىلگەن ئۆز-ئارا تەسىر كۆرسىتىدۇ ، كۆك سىزىقلار ئالدىن پەرەز قىلىنغان ئۆز-ئارا تەسىر كۆرسىتىدۇ.f LC-MS / MS دا ئېنىقلانغان ۋەكىللىك BRD4 باغلاش نىشانى غەربنىڭ پارچىلىنىشى ئارقىلىق دەلىللەندى.g ئورتاق ئىممۇنىتېتلاش تەجرىبىسى SFPQ بىلەن BRD4 ئوتتۇرىسىدىكى ئۆز-ئارا تەسىرنى ئىسپاتلايدۇ.بۇ سىناقلار مۇشۇنىڭغا ئوخشاش نەتىجىلەر بىلەن كەم دېگەندە ئىككى قېتىم مۇستەقىل تەكرارلاندى.خام سانلىق مەلۇمات خام ماتېرىيال ھۆججىتى شەكلىدە تەمىنلەنگەن.
بىز تىزىمغا ئالدۇرمىغان POI بىلەن مۇناسىۋەتلىك نىشانلارنى ئېنىقلىغاندىن باشقا ، بىز PDPL فېرمېنتنىڭ تارماق ئېلېمېنتلىرىنى پەرقلەندۈرۈشكە ماس كېلىدىغانلىقىنى پەرەز قىلىمىز ، بۇ چوڭ تىپتىكى مۇرەككەپ ۋاسىتىلەردە ۋاسىتىلىك باغلىنىشلىق ئاقسىلنىڭ خاراكتېرىنى تەلەپ قىلىپ ، تىزىمغا ئالدۇرمىغان تارماق ماددىلارنى ئىزاھلايدۇ.پاركىن (PARK2 تەرىپىدىن كودلاشتۇرۇلغان) E3 ligase بولۇپ ، پاركىننىڭ ئۆزگىرىشى ئۆزلۈكىدىن چېكىنىش قۇرامىغا يەتمىگەن پاركىنسون كېسىلىنى كەلتۈرۈپ چىقىرىدۇ (AR-JP) 42.ئۇنىڭدىن باشقا ، پاركىن مىتوفاگى (خوندىرىئوسوملۇق ئاپتوماتىك) ۋە ئاكتىپ ئوكسىگېن تۈرىنى يوقىتىشتا ئىنتايىن مۇھىم دەپ تەسۋىرلەنگەن.قانداقلا بولمىسۇن ، بىر قانچە پاركىننىڭ ئاستى قىسمى ئېنىقلانغان بولسىمۇ ، پاركىننىڭ بۇ كېسەلدىكى رولى ئېنىق ئەمەس.ئۇنىڭ خاس بولمىغان تارماق قىسمىنى ئىزاھلاش ئۈچۈن ، PDPL پاركىننىڭ N ياكى C تېرمىنالىغا miniSOG قوشۇش ئارقىلىق سىناق قىلىنغان.ھۈجەيرىلەر كاربونېل سىئانىد پروتون توشۇغۇچى m-chlorophenylhydrazone (CCCP) بىلەن بىر تەرەپ قىلىنىپ ، PINK1-Parkin يولى ئارقىلىق پاركېننى قوزغىتىدۇ.بىزنىڭ BRD4 PDPL نەتىجىسىگە سېلىشتۇرغاندا ، پاركىن N- تېرمىنۇس بىرىكىشى C تېرمىنالىنىڭ تېخىمۇ كۆپ قىسمىنى (210 دىن 177) قاپلىغان بولسىمۇ ، تېخىمۇ چوڭ نىشان ئاقسىلنى ئاشكارىلىدى (5a رەسىم ، b ۋە قوشۇمچە سانلىق مەلۇمات 4).بۇ نەتىجە N تېرمىنال بەلگىسىنىڭ Parkin44 نى قەتئىي قوزغىتالايدىغانلىقى توغرىسىدىكى خەۋەرلەر بىلەن بىردەك.ئادەمنى ھەيران قالدۇرىدىغىنى ، بىزنىڭ سانلىق مەلۇماتلىرىمىزدا Parkin43 نىڭ ئېلان قىلىنغان AP-MS نەتىجىسى بىلەن ئاران 18 قاپلانغان ئاقسىل بار ، بۇ بەلكىم ھۈجەيرە لىنىيىسى بىلەن ئاقسىلنىڭ خىزمەت ئېقىمىنىڭ پەرقىدىن بولۇشى مۇمكىن.ئىككى خىل ئۇسۇل ئارقىلىق ئېنىقلانغان تۆت خىل ئاقسىل (ARDM1, HSPA8, PSMD14 ۋە PSMC3) دىن باشقا (43-رەسىم) 43.LC-MS / MS نىڭ نەتىجىسىنى يەنىمۇ ئىلگىرىلىگەن ھالدا دەلىللەش ئۈچۈن ، PDPL داۋالاش ۋە كېيىنكى غەربنىڭ پارچىلىنىشى HEK293T ئانا ھۈجەيرىسىنى تەكشۈرۈش نەتىجىسى ۋە مۇقىم N تېرمىنال باغچىسى لىنىيىسىنى سېلىشتۇرۇشقا ئىشلىتىلدى.ئىلگىرى نامەلۇم نىشانلار CDK2 ، DUT ، CTBP1 ۋە PSMC4 داڭلىق باغلانما DNAJB1 بىلەن سىناق قىلىنغان (5d رەسىم).
HEK293T ھۈجەيرىسىدىكى پاركىن ئۆز-ئارا تەسىر كۆرسىتىدىغان ئاقسىلنىڭ يانار تاغ پىلانى مۇقىم ئىپادىلەنگەن miniSOG بىلەن پاركىننىڭ N ياكى C تېرمىنالىغا بىرىكتۈرۈلگەن (n = 3 مۇستەقىل بىئولوگىيىلىك تەجرىبە).ئىككى قۇيرۇقلۇق ئوقۇغۇچىلارنىڭ T سىنىقى يانار تاغ مەيدانلىرىدا ئىشلىتىلگەن.HEK293T سەلبىي كونترول سۈپىتىدە ئىشلىتىلگەن. كۆرۈنەرلىك ئۆزگەرتىلگەن ئاقسىل قىزىل رەڭدە گەۋدىلىنىدۇ (p <0.05 ۋە> 2 ھەسسە ئىئون كۈچلۈكلۈك پەرقى). كۆرۈنەرلىك ئۆزگەرتىلگەن ئاقسىل قىزىل رەڭدە گەۋدىلىنىدۇ (p <0.05 ۋە> 2 ھەسسە ئىئون كۈچلۈكلۈك پەرقى). Значительно измененные белki выделены красным цветом (p <0,05 и> 2-кратная разница в интингности ионов). كۆرۈنەرلىك ئۆزگەرتىلگەن ئاقسىل قىزىل رەڭدە گەۋدىلىنىدۇ (p <0.05 ۋە> ئىئوننىڭ كۈچلۈكلۈكىدىكى 2 ھەسسە پەرق).<着 变化 的 蛋白质 以 红色 <<p <0.05 和> 2 倍 离子 强度 差异）。显 着 变化 的 蛋白质 以 红色 <（p <0.05 和> 2 Значительно измененные белki выделены красным цветом (p <0,05 и> 2-кратная разница в ионной силе). كۆرۈنەرلىك ئۆزگەرتىلگەن ئاقسىل قىزىل رەڭدە گەۋدىلىنىدۇ (p <0.05 ۋە> ئىئون كۈچىنىڭ 2 ھەسسىلىك پەرقى).HEK293T-miniSOG ئۈچۈن مۇھىم ، ئەمما HEK293T ئۈچۈن مۇھىم بولمىغان ئاقسىللار يېشىل رەڭدە كۆرسىتىلدى.b Venn دىئاگراممىسى N تېرمىنال بىلەن C تېرمىنال قۇرۇلمىسى ئارىسىدىكى قاپلانغان ئاقسىلنى كۆرسىتىدۇ.N تېرمىنال خەتكۈچلىرى پاركېننى قەتئىي قوزغىتىپ ، تېخىمۇ كۆپ تونۇلىدىغان ئاقسىللارنى ھاسىل قىلالايدۇ.c Venn دىئاگراممىسى PDPL بىلەن AP-MS ئارىسىدىكى قاپلانغان ئاقسىلنى كۆرسىتىدۇ.داڭلىق ئۆز-ئارا تەسىر كۆرسىتىدىغان تىزىملىكلەر بار ، بۇنىڭ ئىچىدە 18 خىل قاپلانغان ئاقسىلنىڭ 4 ى ۋە PDPL دا ئېنىقلانغان 159 ئاقسىلنىڭ 11 ى بار.d LC-MS / MS تەرىپىدىن بېكىتىلگەن ۋەكىللىك نىشان غەربنىڭ پارچىلىنىشى ئارقىلىق تەكشۈرۈلدى.e Ssu72 ۋە SNW1 رويخەتكە ئالدۇرمىغان پاركىننىڭ ئاستى قىسمى دەپ بېكىتىلدى.بۇ FLAG بەلگىسى چۈشۈرۈلگەن ئاقسىل پلازمىسى HEK293T ۋە HEK293T-Parkin-miniSOG غا ئالماشتۇرۇلدى ، ئاندىن CCCP ھەرخىل ۋاقىت نۇقتىلىرىدا داۋالاش ئېلىپ باردى.پاركىننىڭ ھەددىدىن زىيادە بېسىم سىزىقىدا چېكىنىش تېخىمۇ كۆرۈنەرلىك بولدى.f ئاقسىلنى تىزگىنلىگۈچى MG132 نى ئىشلىتىپ ، Ssu72 ۋە SNW1 نىڭ بۇزۇلۇش جەريانىنىڭ ئاقسىل-ھەممە يەرنى قاپلاش ئارقىلىق ۋاسىتە قىلىنغانلىقى جەزملەشتۈرۈلدى.بۇ سىناقلار مۇشۇنىڭغا ئوخشاش نەتىجىلەر بىلەن كەم دېگەندە ئىككى قېتىم مۇستەقىل تەكرارلاندى.خام سانلىق مەلۇمات خام ماتېرىيال ھۆججىتى شەكلىدە تەمىنلەنگەن.
تىلغا ئېلىشقا ئەرزىيدىغىنى ، PDPL تەرىپىدىن ئېنىقلانغان ئاقسىللار چوقۇم پاركىن باغلايدىغان ئاقسىل ۋە ئۇلارنىڭ ئاستى قىسمىنى ئۆز ئىچىگە ئېلىشى كېرەك.تىزىمغا ئالدۇرمىغان پاركىننىڭ ئاستى قىسمىنى بايقاش ئۈچۈن ، بىز ئېنىقلانغان يەتتە خىل ئاقسىلنى تاللىدۇق (PUF60, PSPC1, UCHL3, PPP1R8, CACYBP, Ssu72 ۋە SNW1) ۋە پىلازما ئارقىلىق بۇ گېنلارنى نورمال HEK293T غا ئاشكارىلاپ ، miniSOG-Parkin نىڭ HEK293T ئارقىلىق مۇقىم ئىپادىلىدۇق.مۇقىم miniSOG-Parkin لىنىيىسىدە Ssu72 ۋە SNW1 ئاقسىلىنىڭ مىقدارى كۆرۈنەرلىك تۆۋەنلىدى (5e رەسىم).CCCP بىلەن 12 سائەت داۋالاش نەتىجىسىدە ، ئىككىلەمچى ماددىنىڭ ئەڭ كۆرۈنەرلىك ناچارلىشىشىنى كەلتۈرۈپ چىقاردى.Ssu72 ۋە SNW1 نىڭ تۆۋەنلىشىنىڭ ئاقسىلنىڭ ھەممە يەرنى قاپلىشى بىلەن تەڭشەلگەن-تەڭشەلمىگەنلىكىنى تەكشۈرۈش ئۈچۈن ، ئاقسىلنى تىزگىنلىگۈچى MG132 ئاقسىل ھەرىكىتىنى تورمۇزلاشقا قوشۇلدى ، ئەمەلىيەتتە بىز ئۇلارنىڭ ناچارلىشىش جەريانىنىڭ چەكلەنگەنلىكىنى بايقىدۇق (5-رەسىم).قوشۇمچە بولمىغان قوشۇمچە نىشانلار LC-MS / MS بىلەن بىردەك نەتىجىنى كۆرسەتكەن غەربنىڭ پارچىلىنىشى (قوشۇمچە 10-رەسىم) دىن پاركىن ئۆز-ئارا تەسىر كۆرسىتىدىغانلىقى جەزملەشتۈرۈلدى.خۇلاسىلىگەندە ، PDPL خىزمەت ئېقىمىنىڭ نىشانلىق ئاقسىلنىڭ يۆتكىلىشىنى دەلىللەش بىلەن بىرلەشتۈرۈلمىگەن ، تىزىمغا ئالدۇرمىغان E3 ligase تارماق ئېلېمېنتلىرىنى پەرقلەندۈرگىلى بولىدۇ.
بىز ئورتاق يېقىن بەلگە سۇپىسىنى ياساپ چىقتۇق ، ئۇ بوشلۇق ۋە ۋاقىت ئۆز-ئارا تەسىر كۆرسىتىدىغان POI لارنى پەرقلەندۈرەلەيسىز.بۇ سۇپا miniSOG فوتوسىنتېزلاش ئاقسىلىنى ئاساس قىلغان بولۇپ ، ئاران 12 kDa ئەتراپىدا ، پىشىپ يېتىلگەن APEX2 ئېنزىمنىڭ (27 kDa) يېرىمىغىمۇ يەتمەيدۇ ، TurboID نىڭ چوڭلۇقى (35 kDa).كىچىكرەك كىچىك ئاقسىل ئۆز-ئارا تەسىرنى تەتقىق قىلىدىغان قوللىنىشچان پروگراممىلارنى كېڭەيتىشى كېرەك.قوشۇمچە فوتوسېنېرلاشتۇرغۇچنى يەنىمۇ ئىلگىرىلىگەن ھالدا تەتقىق قىلىش ، مەيلى گېن كودلانغان ئاقسىل ياكى كىچىك مولېكۇلا بولسۇن ، يەككە ئوكسىگېننىڭ كىۋانت مەھسۇلات مىقدارىنى ئاشۇرۇش ۋە بۇ خىل ئۇسۇلنىڭ سەزگۈرلۈكىنى كېڭەيتىش كېرەك.ھازىرقى نۇسخىدىكى miniSOG غا نىسبەتەن يۇقىرى يورۇقلۇق دەرىجىسى كۆك يورۇتۇش ئارقىلىق يېقىنلىق بەلگىسىنى قوزغىتىشقا بولىدۇ.بۇنىڭدىن باشقا ، ئاشكارلىنىش ۋاقتى ئۇزۇنراق يەككە ئوكسىگېننىڭ تېخىمۇ چوڭ «بۇلۇت» ىنى قويۇپ بەردى ، نەتىجىدە تېخىمۇ يىراق بولغان گىستودىن قالدۇقى ئۆزگەرتىلدى ، بەلگە رادىئوسى كۆپەيدى ۋە PDPL بوشلۇقنىڭ ئېنىقلىق دەرىجىسىنى ئىنچىكە تەڭشەش ئىقتىدارى بارلىققا كەلدى.بىز يەنە يەتتە خىل خىمىيىلىك تەكشۈرۈشنى سىناق قىلىپ ، سىگنالنىڭ ئارقا كۆرۈنۈش نىسبىتىنى ئۆستۈردۇق ۋە بۇ خىل ئۇسۇلنىڭ ئارقىسىدىكى مولېكۇلا مېخانىزىمى ئۈستىدە ئىزدەندۇق.TOP-ABPP خىزمەت ئېقىمى تەرەپسىز ئوچۇق ئىزدەش بىلەن بىرلەشتۈرۈلۈپ ، ئۆزگىرىشنىڭ پەقەت گىستودېندىلا يۈز بەرگەنلىكى ، ئايلانما رايوندىكى گىستودېنغا مۇۋاپىق دەرىجىدە مايىل بولغاننى ھېسابقا ئالمىغاندا ، گىستودېننىڭ ئۆزگىرىشىدە ئىزچىل مىكرو مۇھىتنىڭ كۆرۈلمىگەنلىكى ئىسپاتلاندى.
PDPL يەنە ئاقسىلنىڭ خاسلىقى ۋە قاپلىنىش دائىرىسى بىلەن ھۈجەيرە ئەتراپىدىكى ئاقسىلنى سۈپەتلەشكە ئىشلىتىلىدۇ ، ھېچ بولمىغاندا باشقا يېقىنلىق بەلگىسى ۋە ئورگانىكلارغا خاس خىمىيىلىك تەكشۈرۈش ئۇسۇللىرى بىلەن سېلىشتۇرغىلى بولىدۇ.يېقىنلىق بەلگىسى يەنە مۇۋەپپەقىيەتلىك ھالدا يەر يۈزى ، لىزوسوما ۋە مەخپىي مۇناسىۋەتلىك ئاقسىللارنى تەسۋىرلەشكە ئىشلىتىلگەن.ئىشىنىمىزكى PDPL بۇ تارماق ھۈجەيرىلەر بىلەن ماسلىشالايدۇ.ئۇنىڭدىن باشقا ، بىز ھەرىكەتچان خۇسۇسىيىتى ۋە ۋاقىتلىق ئۆز-ئارا تەسىرگە ئارىلىشىشى سەۋەبىدىن پەردىگە باغلانغان ئاقسىلغا قارىغاندا مۇرەككەپ بولغان سىتوسوللىق ئاقسىل باغلاش نىشانىنى ئېنىقلاش ئارقىلىق PDPL غا جەڭ ئېلان قىلدۇق.PDPL ترانسكرىپسىيەلىك ئاكتىپلاشتۇرغۇچى BRD4 ۋە كېسەللىككە مۇناسىۋەتلىك لىگاس E3 پاركىندىن ئىبارەت ئىككى خىل ئاقسىلغا قوللىنىلدى.بۇ ئىككى خىل ئاقسىل ئۇلارنىڭ ئاساسىي بىئولوگىيىلىك رولى ئۈچۈنلا ئەمەس ، بەلكى ئۇلارنىڭ كلىنىكىلىق ئەھمىيىتى ۋە داۋالاش يوشۇرۇن كۈچى ئۈچۈنمۇ تاللانغان.بۇ ئىككى POI ئۈچۈن ، داڭلىق باغلىنىشلىق شېرىكلەر شۇنداقلا تىزىملاتمىغان نىشانلار ئېنىقلاندى.دىققەت قىلىشقا ئەرزىيدىغىنى ، فازا ئايرىشقا مۇناسىۋەتلىك ئاقسىل SFPQ ئورتاق IP تەرىپىدىن دەلىللەنگەن ، بۇ بەلكىم BRD4 (قىسقا ئىزفورم) LLPS نى تەڭشەيدىغان يېڭى مېخانىزىمنى كۆرسىتىشى مۇمكىن.شۇنىڭ بىلەن بىر ۋاقىتتا ، بىز پاركىننىڭ ئاستى قىسمىنى پەرقلەندۈرۈشنىڭ ۋاسىتىلىك يېپىشقاق ماددىلارنى پەرقلەندۈرۈشنى تەلەپ قىلىدىغان سىنارىيە ئىكەنلىكىگە ئىشىنىمىز.بىز نامەلۇم ئىككى پاركىن سۇ ئاستى يولىنى ئېنىقلىدۇق ۋە ئۇلارنىڭ ھەممە يەرنى قاپلاش-ئاقسىل يولىنى بويلاپ ناچارلاشقانلىقىنى جەزملەشتۈردۇق.يېقىندا ، مېخانىزم ئاساس قىلىنغان قاپلاش ئىستراتېگىيىسى تۈزۈلۈپ ، فېرمېنت بىلەن تۇزاق ئارقىلىق ھىدروزا سۇيۇقلۇقىنى بايقىغىلى بولىدۇ.گەرچە بۇ ئىنتايىن كۈچلۈك ئۇسۇل بولسىمۇ ، ئەمما ئۇ چوڭ مۇرەككەپ ماددىلارنىڭ شەكىللىنىشىگە قاتناشقان تارماق ئېلېمېنتلارنى تەھلىل قىلىشقا ماس كەلمەيدۇ ھەمدە فېرمېنت بىلەن بالا ھەمراھى ئوتتۇرىسىدا يانتۇ باغلىنىش شەكىللەندۈرۈشنى تەلەپ قىلىدۇ.بىز PDPL نى كېڭەيتىپ ، باشقا ئاقسىللار ۋە ئېنزىم ئائىلىلىرىنى تەتقىق قىلالايمىز ، مەسىلەن دېببىكۇتىنازا ۋە مېتاللوپروتازا ئائىلىسى.
يەككە ئوكسىگېن ئىشلەپچىقىرىشنىڭ ياخشىلىنىشى بىلەن SOPP3 دەپ ئاتىلىدىغان يېڭى تىپتىكى miniSOG بارلىققا كەلدى.بىز miniSOG نى SOPP3 بىلەن سېلىشتۇرۇپ ، سىگنال بىلەن شاۋقۇن نىسبىتى ئۆزگەرمىگەن بولسىمۇ ، بەلگە ئۈنۈمىنىڭ ياخشىلىنىدىغانلىقىنى بايقىدۇق (قوشۇمچە 11-رەسىم).بىز SOPP3 نىڭ ئەلالاشتۇرۇلۇشى (مەسىلەن ، تەدرىجىي تەرەققىيات ئارقىلىق) تېخىمۇ ئۈنۈملۈك يورۇقلۇق ۋاقتىنى تەلەپ قىلىدىغان تېخىمۇ ئۈنۈملۈك فوتوسىنتېزلاش ئاقسىلىنى كەلتۈرۈپ چىقىرىدۇ ، شۇڭا تېخىمۇ ھەرىكەتچان ھۈجەيرە جەريانىنى تۇتقىلى بولىدۇ دەپ پەرەز قىلدۇق.دىققەت قىلىشقا ئەرزىيدىغىنى ، PDPL نىڭ ھازىرقى نۇسخىسى ھۈجەيرە مۇھىتى بىلەنلا چەكلىنىدۇ ، چۈنكى ئۇ كۆك نۇرنى يورۇتۇشنى تەلەپ قىلىدۇ ھەمدە چوڭقۇر توقۇلمىلارغا سىڭىپ كىرەلمەيدۇ.بۇ ئىقتىدار ئۇنىڭ ھايۋان مودېل تەتقىقاتىدا ئىشلىتىلىشىنى چەكلەيدۇ.قانداقلا بولمىسۇن ، ئوپتىگېنېتىكنىڭ PDPL بىلەن بىرىكىشى ھايۋانلارنى تەتقىق قىلىش پۇرسىتى بىلەن تەمىنلەيدۇ ، بولۇپمۇ مېڭىدە.ئۇنىڭدىن باشقا ، باشقا ئىنژېنېرلىق ئىنفىرا قىزىل نۇرلۇق نۇر تارتقۇچىلارمۇ بۇ چەكلىمىنى چىقىرىپ تاشلايدۇ.ھازىر بۇ ساھەدە تەتقىقاتلار ئېلىپ بېرىلماقتا.
HEK293T كاتەكچە لىنىيىسى ATCC (CRL-3216) دىن ئېلىنغان.بۇ ھۈجەيرە لىنىيىسى مىكوپلازما بىلەن يۇقۇملىنىشنىڭ مەنپىيلىكىنى سىنىدى ۋە DMEM (تېرمو ، # C11995500BT) دا% 10 تۆرەلمە كالا قان زەردابى (FBS ، Vistech ، # SE100-B) ۋە% 1 پېنىتسىللىن / سترېپتومىيسىن (Hyclone ، # SV30010) تولۇقلاندى.چوڭ بولدى.
3-ئامىنوفېنىلېن (ئەۋرىشكە 3) ۋە (4-ئېتىنىلفېنىل) مېتانامىن (4-ئەۋرىشكە) بىدېفارمدىن سېتىۋېلىندى.پروپلامىن (تەكشۈرۈش 2) ئېنېرگىيە-خىمىيىلىك ماددىلاردىن سېتىۋېلىندى.N- (2-Aminophenyl) pent-4-ynamide (تەكشۈرۈش 1) ئېلان قىلىنغان ئۇسۇللار بويىچە بىرىكتۈرۈلدى.
قوشۇمچە 1-جەدۋەلدە بۇ تەتقىقاتتا ئىشلىتىلگەن گېن قۇرۇلمىلىرى كۆرسىتىلدى.MiniSOG ۋە KillerRed تەرتىپلىرى P. Zou (بېيجىڭ ئۇنىۋېرسىتېتى) نىڭ سوۋغات پىلاستىنكىسىدىن كلونلانغان.خوندىرىئوسوملۇق ماترىسسا نىشان تەرتىپى COX4 نىڭ 23 N تېرمىنال ئامىنو كىسلاتاسىدىن ھاسىل قىلىنغان ۋە گىبسون قۇراشتۇرۇشى ئارقىلىق كۆرسىتىلگەن ۋېكتورلارغا كلونلانغان (Beyotime, # D7010S).بالىياتقۇ ئىچكى پەردىسىنىڭ پەردىسى ۋە يادروسىنى نىشانلاش ئۈچۈن ، SEC61B ئىنسانلارنىڭ DNA سى (NM_006808.3) (NEB, # M0491L) PCR تەرىپىدىن HEK293T ھۈجەيرىسىنىڭ cDNA كۈتۈپخانىسىدىن كۈچەيتىلگەن ۋە H2B DNA (شېنجېن قولتۇقى تەجرىبىخانىسى D. لىن ئىئانە قىلغان). ۋە يۇقىرىدا دېيىلگەندەك كلونلانغان.باشقىچە كۆرسىتىلمىگەن بولسا ، مۇقىم ھۈجەيرە لىنىيىسىنى يەتكۈزۈش ۋە ياساشقا ئىشلىتىلىدىغان باشقا ئاقسىل گېنى HEK293T ھۈجەيرە cDNA كۈتۈپخانىسىدىن PCR كۈچەيتىلگەن.G3S (GGGS) بىلەن G4S (GGGGS) يەمچۈك ئاقسىلى بىلەن miniSOG نىڭ ئۇلىنىشى سۈپىتىدە ئىشلىتىلگەن.بۇ بىرىكتۈرۈش قۇرۇلمىلىرىغا V5 epitope بەلگىسى (GKPIPNPLLGLDST) قوشۇلدى.سۈت ئەمگۈچىلەردە ئىپادىلەش ۋە مۇقىم ھۈجەيرە سىزىقى ئورنىتىش ئۈچۈن ، miniSOG بىرىكتۈرۈش قۇرۇلمىسى pLX304 لىمفا ۋىرۇسىغا بۆلۈندى.باكتېرىيە ئىپادىلەش ئۈچۈن ، miniSOG C تېرمىنالىدا 6xHis دەپ يېزىلغان pET21a ۋېكتورىغا كلونلانغان.
HEK293T ھۈجەيرىلىرى ئالتە قۇدۇق تاختىسىدىكى ھەر بىر قۇدۇققا 2.0 x 105 ھۈجەيرىگە ئۇرۇق سېلىنىپ ، 24 سائەتتىن كېيىن قايتا ھاسىل بولغان لىمفا ۋىرۇسى پىلازمىسى (2.4 mgg pLX304) ۋە ۋىرۇس ئوراپ قاچىلاش پلازمىسى (1.5 mg psPAX2 ۋە 1.2 mg pMD2.G) بىلەن Lipo8000 (Beyotime) نى ئىشلىتىپ ئالماشتۇرۇلدى. ، # C0533) ، تەخمىنەن% 80 بىرىكىش.بىر كېچىدىلا يۆتكەلگەندىن كېيىن ، ۋاسىتە ئۆزگەرتىلىپ يەنە 24 سائەت سىڭدۈرۈلدى.ۋىرۇسنى يىغىش 24 ، 48 ۋە 72 سائەتتىن كېيىن ئېلىپ بېرىلغان.نىشان ھۈجەيرە لىنىيىسى يۇقۇملىنىشتىن ئىلگىرى ، ۋىرۇسلۇق ۋاسىتە 0.8 مىللىمېتىر سۈزگۈچ (Merck, # millex-GP) ئارقىلىق سۈزۈلۈپ ، پولىبرېن (Solarbio, # H8761) قويۇقلۇقى 8 mg / ml غا قوشۇلدى.24 سائەتتىن كېيىن ، ھۈجەيرىلەرنى ۋاسىتە ئارقىلىق ئەسلىگە كەلتۈرۈشكە رۇخسەت قىلىندى.ھۈجەيرىلەر ئالدىنقى ئۈچ بۆلەك ئۈچۈن تۆۋەن دەرىجىدىكى قاتتىق تاللاش سۈپىتىدە 5 mgg / ml blasticidin (Solarbio, # 3513-03-9) ئارقىلىق تاللانغان.ئاندىن كېيىنكى ئۈچ بۆلەك ئۈچۈن 20 mgg / ml نى تېخىمۇ قاتتىق تەرتىپ قىلىپ ئىشلەتتى.
ھۈجەيرىلەر 12 قۇدۇق ئۆيدە (Ibidi ، # 81201) ھەر بىر قۇدۇققا تەخمىنەن 20،000 ھۈجەيرە زىچلىقىدا ئۇرۇقلانغان.HEK293T ھۈجەيرىسىنىڭ يېپىشقاقلىقىنى ياخشىلاش ئۈچۈن ، 37 سېلسىيە گرادۇسلۇق فوسفات بۇففېرلىق تۇز (PBS ، سانگون ، # B640435) دا سۇيۇلدۇرۇلغان 50 µg / ml تالالىق فرونون (Corning, # 356008) نى قوشۇڭ.كامېرلار 1 سائەت ئالدىن ياسالغان ، ئاندىن PBS بىلەن ئېلىۋېتىلگەن.24 سائەتتىن كېيىن ، ھۈجەيرىلەر PBS بىلەن بىر قېتىم يۇيۇلدى ، يېڭى خەنكىسنىڭ تەڭپۇڭ تۇز ئېرىتمىسى (HBSS, Gibco, # 14025092) دىكى 1 mM تەكشۈرۈش ئەسۋابى بىلەن ° C 37 قا چىقتى ، ئاندىن كۆك LED (460 nm) سىلىندى. ).) ئۆي تېمپېراتۇرىسىدا 10 مىنۇت رادىئاتسىيە قىلىندى.ئۇنىڭدىن كېيىن ، ھۈجەيرىلەر PBS بىلەن ئىككى قېتىم يۇيۇلۇپ ، PBS (سانگون ، # E672002) دىكى% 4 فورمالدېگىد بىلەن ئۆي تېمپېراتۇرىسىدا 15 مىنۇت مۇقىملاشتۇرۇلدى.ئارتۇقچە فورمالدېگىد PBS بىلەن ئۈچ قېتىم يۇيۇش ئارقىلىق مۇقىم ھۈجەيرىلەردىن چىقىرىۋېتىلدى.ھۈجەيرىلەر PBS دىكى% 0.5 Triton X-100 (سانگون ، # A600198) بىلەن مۇقىملاشتۇرۇلدى ۋە PBS بىلەن 3 قېتىم يۇيۇلدى.ئاندىن كامېرنى ئېلىۋېتىپ ، ھەر بىر ئەۋرىشكە 25 µl چېكىش رېئاكسىيە ئارىلاشمىسىغا 50 µM Cy3-azide (ئالادىن ، # C196720) ، 2 mM CuSO4 (سانگون ، # A603008) ، 1 mM BTTAA (Confluore, # BDJ-4) قوشۇڭ. ۋە 0.5 mg / ml ناترىي ئاسكوربات (ئالادىن ، S105024 نومۇرلۇق) ۋە ئۆي تېمپېراتۇرىسىدا 30 مىنۇت سىڭدۈرۈلگەن.ئۇششاق-چۈششەك ئىنكاستىن كېيىن ، ھۈجەيرىلەر PBST بىلەن% 0.05 لىك Tween-20 (سانگون ، # A600560) (PBST) بىلەن ئالتە قېتىم يۇيۇلدى ، ئاندىن ئۆي تېمپېراتۇرىسىدا PBST دا% 5 BSA (Abcone, # B24726) بىلەن توسۇلدى.
كوكوللاشتۇرۇش ئىممۇنىتېتلاش ئۈچۈن ، ھۈجەيرىلەر كۆرسىتىلگەن شەرتلەرگە ئاساسەن دەسلەپكى ئانتىتېلا بىلەن سىڭدۈرۈلگەن: چاشقانغا قارشى V5 بەلگىسى mAb (1: 500 ، CST ، # 80076) ، توشقان Hsp60 mAb (1: 1000) ، ABclonal ، # A0564) ، توشقان پولىككالونغا قارشى ئانتىتېلا (1: 500 ، ئابكام ، # ab22595) ياكى توشقاننىڭ لامىنغا قارشى A / C يەككە ئانتىتېلاسى (1: 500 ؛ CST ، # 2032) بىر كېچىدىلا 4 سېلسىيە گرادۇس.PBST بىلەن 3 قېتىم يۇيۇلغاندىن كېيىن ، ھۈجەيرىلەرگە ئىككىلەمچى ئانتىتېلا سىڭدۈرۈلدى: ئۆچكە توشقانغا قارشى ئالېكسانا فلورى 488 (تېرمو ، # A11034) 1: 1000 سۇيۇلدى ، ئۆچكە چاشقانغا قارشى ئالېكسانا فلۇئور 594 (CST ، # 8889) 1: 1000 سۇيۇلدى.سۇيۇقلۇق ئۆي تېمپېراتۇرىسىدا 30 مىنۇت سۇيۇلدۇرۇڭ.ئاندىن ھۈجەيرىلەر PBST بىلەن 3 قېتىم يۇيۇلدى ۋە ئۆي تېمپېراتۇرىسىدا 10 مىنۇت PBS دىكى DAPI (تېرمو ، # D1306) بىلەن قارشى ئېلىندى.PBS بىلەن 3 قېتىم يۇيۇلغاندىن كېيىن ، ھۈجەيرىلەر PBS دىكى% 50 گلىتسېرىن (سانگون ، # A600232) دا پېچەتلەنگەن.Immunofluorescent رەسىملىرى ZEISS LSM 900 Airyscan2 ماسلاشتۇرۇلغان مىكروسكوپ ۋە ZNE 3.5 يۇمشاق دېتالى ئارقىلىق ئېلىنغان.
يەككە ئوكسىگېن فلۇئورېسسېنسىيە تەسۋىر ھاسىل قىلىش ئۈچۈن ، Hanks HEPES بۇففېرغا 100 nM Si-DMA قوشۇشتىن بۇرۇن ھۈجەيرىلەر ئىككى قېتىم Hanks HEPES بۇففېر بىلەن يۇيۇلدى (DOJINDO, # MT05).نۇرغا ئۇچرىغاندىن كېيىن ، ھۈجەيرىلەر 37 سېلسىيە گرادۇسلۇق CO2 ئىنكۇباتورغا 45 مىنۇت سىڭدۈرۈلگەن.ھۈجەيرىلەر ئاندىن ئىككى قېتىم خەنكىسنىڭ HEPES بۇففېر بىلەن يۇيۇلۇپ ، خەنكنىڭ HEPES بۇففېردىكى Hoechst بىلەن ئۆي تېمپېراتۇرىسىدا 10 مىنۇت تۇرغۇزۇلغان ۋە ZEISS LSM 900 ماسلاشتۇرۇلغان مىكروسكوپ ئارقىلىق تەسۋىرلەنگەن.، # M36008) تەركىبىدە كالتسىي ۋە ماگنىي بار HBSS بۇففېر.نۇر ياكى دوكسورۇبىسىن (MCE, # HY-15142A) بىلەن ئۇچراشقاندىن كېيىن ، ھۈجەيرىلەر CO2 ئىنكۇباتورىدا 37 سېلسىيە گرادۇستا 10 مىنۇت سىلىندى ، HBSS بۇففېر بىلەن ئىككى قېتىم يۇيۇلدى ، ئۆي تېمپېراتۇرىسىدا HechS بۇففېردا Hoechst بىلەن سىڭدۈرۈلدى.مىنۇت.Doxorubicin مۇسبەت تەكشۈرۈش ئەسۋابى سۈپىتىدە ئىشلىتىلگەن ، HBSS دىكى ھۈجەيرىلەر% 1 لىك BSA بولغان 30 مىنۇتتا 20 μ mM doxorubicin بىلەن بىر تەرەپ قىلىنغان.Immunofluorescent سۈرەتلىرى Zeiss LSM 900 ماسلاشتۇرۇلغان مىكروسكوپ ئارقىلىق ئېرىشكەن.
HEK293T ھۈجەيرىلىرى mito-miniSOG نى مۇقىم ئىپادىلەيدىغان ھۈجەيرىلەر 15 سانتىمېتىرلىق تاماقتا تەخمىنەن% 30 زىچلىقتا ئۇرۇقلانغان.48 سائەتتىن كېيىن ،% 80 لىك تۇتاشتۇرۇشقا يەتكەندە ، ھۈجەيرىلەر PBS بىلەن بىر قېتىم يۇيۇلدى ، يېڭى HBSS بۇففېردا 1 mM Probe 3 بىلەن 37 سېلسىيە گرادۇستا 1 سائەت تۇرغۇزۇلدى ، ئاندىن كۆك رەڭلىك LED بىلەن ئۆيدە 10 مىنۇت يورۇتۇلدى. تېمپېراتۇرا..ئۇنىڭدىن كېيىن ، ھۈجەيرىلەر PBS بىلەن ئىككى قېتىم يۇيۇلدى ، بىراك قىلىندى ۋە مۇز سوغۇق PBS بۇففېردا EDTA يوق ئاقسىل چەكلىگۈچى (MCE, # HY-K0011) بار.ھۈجەيرىلەر ئۇچىنى سونىكلاش ئارقىلىق 1 مىنۇت (% 35 ئامپلىتسىيەدە 1 سېكۇنت ، 1 سېكۇنت ئارام ئېلىش) ئارقىلىق لايلانغان.بۇنىڭدىن ھاسىل بولغان ئارىلاشما 15 سېلسىيە گرادۇستا 15871 xg ئەتراپىدا 10 سېلسىيە گرادۇستا 4 مىنۇتتا ئەخلەت چىقىرىۋېتىلدى ، خاسىيەتلىك ماددىنىڭ قويۇقلۇقى BCA ئاقسىل تەكشۈرۈش ئەسۋابى (Beyotime, # P0009) ئارقىلىق 4 mg / mL غا تەڭشەلدى.يۇقارقى لىماتنىڭ 1 مىللىلىتىرنى 0.1 mM فوتوگرافىكلىق بىئوتىن ئازد (Confluore, # BBBD-14) ، 1 mM TCEP (سانگون ، # A600974) ، 0.1 mM TBTA ligand (Aladdin, # T162437) ۋە 1 mM CuSO4 ئىنكۇباتور بىلەن بىرلەشتۈرۈڭ. ئۆي تېمپېراتۇرىسىدا 1 سائەت ئايلىنىش.ئۇششاق-چۈششەك ئىنكاستىن كېيىن ، ئارىلاشما ماددىلارنى ئالدىن ئارىلاشتۇرۇلغان ئېرىتمىگە (MeOH: CHCl3: H2O = 4 مىللىمېتىر: 1 مىللىمېتىر: 3 مىللىمېتىر) 10 مىللىمېتىر ئەينەك قاچىغا سېلىڭ.ئەۋرىشكەلەر ئارىلاشتۇرۇلۇپ 4500 گرام ئۆي تېمپېراتۇرىسىدا 10 مىنۇت مەركەزلەشتۈرۈلدى.ئاستىنقى ۋە ئۈستۈنكى ئېرىتمىلىرى تاشلىۋېتىلدى ، چۆكمە 1 مىللىلېتىر مېتانول بىلەن ئىككى قېتىم يۇيۇلدى ۋە 15871 × گرامدا 5 سېلسىيە گرادۇستا 5 مىنۇت مەركەزلەشتۈرۈلدى.25 مىللىمېتىرلىق ئاممونىي ئىككى كاربونات (ABC ، ​​ئالادىن ، A110539) غا 8 مىللىمېتىر ئۇرېيە (ئالادىن ، U111902) دىن 1 مىللىلېتىر قوشۇپ ، چۆكمىنى ئېرىتىش كېرەك.ئەۋرىشكەلەر 10 mM دىتىئوترىتول (سانگون ، 25MM ABC دىكى # A100281) بىلەن 40 سېلسىيە گرادۇستا 40 مىنۇت قايتا قۇرۇلدى ، ئاندىن قاراڭغۇدا ئۆي تېمپېراتۇرىسىدا 15 مىللىمېتىر يېڭى يود كىسلاتاسى (سانگون ، # A600539) قوشۇلدى.30 مىنۇت ئىچىدە ئىشقار..ئىنكاسنى توختىتىش ئۈچۈن قوشۇمچە 5 mM دىتىئوترىتول قوشۇلدى.ھەر بىر ئەۋرىشكە ئۈچۈن تەخمىنەن 100 µl NeutrAvidin ئاگاروزا مونچاق (تېرمو ، # 29202) تەييارلاڭ ، 1 مىللىلېتىر PBS بىلەن 3 قېتىم يۇيۇپ.يۇقارقى ئاقسىل ئېرىتمىسى 5 مىللىمېتىر PBS بىلەن سۇيۇلدۇرۇلدى ۋە ئالدىن يۇيۇلغان NeutrAvidin ئاگاروزا مونچاق بىلەن ئۆي تېمپېراتۇرىسىدا 4 سائەت سىڭدۈرۈلدى.ئاندىن مونچاقلار% 0.2 لىك SDS (سانگون ، # A600485) بولغان 5 مىللىمېتىر PBS بىلەن 3 قېتىم ، 3 قېتىم 5 مىللىلېتىر PBS بىلەن 1M ئۇرېيە ، 3 قېتىم 5 مىللىلېتىر ddH2O بىلەن يۇيۇلدى.ئاندىن بۇ مونچاقلار مەركەزدىن قاچۇرۇش ئارقىلىق يىغىۋېلىندى ۋە 25 mM ABC نىڭ 200 مىللىمېتىردا 1 M ئۇرېيە ، 1 mM CaCl 2 (ماكلىن ، # C805228) ۋە 20 ng / μl تىرىپسىن (Promega ، # V5280) بار.37 سېلسىيە گرادۇسلۇق ئايلىنىش ئارقىلىق بىر كېچىدىلا سىناپ بېقىڭ.PH 2-3 گە يەتكۈچە فورما كىسلاتا (تېرمو ، # A117-50) قوشۇش ئارقىلىق ئىنكاس توختىتىلدى.مونچاقلار% 0.2 SDS بولغان 1 مىللىلېتىر PBS بىلەن 3 قېتىم ، 3 مىللىلېتىر PBS بىلەن 1 M ئۇرېيە ، 3 قېتىم 1 مىللىلېتىر سۇ بىلەن 3 قېتىم يۇيۇلدى.ئۆزگەرتىلگەن پېپتىدلار% 70 لىك MeOH نىڭ 200 مىللىمېتىردىن پايدىلىنىپ 90 مىنۇتتا يېنىك لىز (365 nm) قويۇپ بېرىلدى.مەركەزدىن قاچقاندىن كېيىن ، خاسىيەتلىك ئادەم يىغىلدى.ئاندىن مونچاقلار% 70 لىك MeOH نىڭ 100 مىللىمېتىر بىلەن بىر قېتىم يۇيۇلدى ۋە خاسىيەتلىك ماددىلار بىرلەشتۈرۈلدى.ئەۋرىشكەلەر Speedvac ۋاكۇئۇم قويۇقلۇقىدا قۇرۇتىلىپ ئانالىز قىلىنغانغا قەدەر -20 سېلسىيە گرادۇستا ساقلانغان.
يەككە ئوكسىگېن ئۆزگەرتىلگەن پېپتىدلارنى ئېنىقلاش ۋە مىقدارلاشتۇرۇش ئۈچۈن ، ئەۋرىشكە% 0.1 لىك فورمات كىسلاتادا قايتا ئېرىتىلگەن ۋە ساتقۇچىلار يۇمشاق دېتالىنىڭ Tune ۋە Xcalibur دىن كەلگەن نانو ESI مەنبەسى قاچىلانغان Orbitrap Fusion Lumos Tribrid ئاممىۋى سپېكترى ئارقىلىق ئانالىز قىلىنغان.ئەۋرىشكەلەر 75 µm × 15 سانتىمېتىرلىق ئىچكى ئورالغان قىل قان تومۇردا 3 µm C18 ماتېرىيال (ReproSil-pur, # r13.b9.) بىلەن ئايرىپ ، EASY-nLC 1200 UHPLC سىستېمىسى (تېرمو) غا ئۇلاندى.پېپتىدلار تۈز سىزىقلىق 95 مىنۇتلۇق ئاستا-ئاستا خروموگرافىيە ئارقىلىق% 8 ئېرىتكۈچى B دىن% 50 ئېرىتكۈچى B (سۇدىكى A = 0.1% لىك كىسلاتا ،% 80 لىك ئاتسېتىنىترىل تەركىبىدىكى B = 0.1% لىك كىسلاتا) بىلەن ئايرىلدى ، ئاندىن سىزىقلىق ھالدا% 98 كە يەتتى. 6 مىنۇتتا ئېقىش سۈرئىتى 300 nl / min.Orbitrap Fusion Lumos سانلىق مەلۇماتقا ئاساسەن تولۇق MS سىكانىرلاش بىلەن MS2 سىكانىرلاش ئارىسىدا ئالمىشىپ سانلىق مەلۇمات توپلايدۇ.پۈركۈش بېسىمى 2.1 كىلوۋولتقا تەڭشەلدى ، ئىئون توشۇش قىل قان تومۇرنىڭ تېمپېراتۇرىسى ° C20 بولدى.MS سپېكترى (350-2000 m / z) ئېنىقلىق دەرىجىسى 120،000 ، AGC 4 × 105 ، ئەڭ چوڭ كىرگۈزۈش ۋاقتى 150 ms.ھەر بىر تولۇق سىكانېرلاشتا ئەڭ كۆپ ئۇچرايدىغان 10 قېتىم كۆپەيتىلگەن ئالدىنئالا ئالدىنئالا سوقۇلۇش ئېنېرگىيىسى HCD ئارقىلىق پارچىلىنىپ كەتتى ، نورمال سوقۇلۇش ئېنېرگىيىسى% 30 ، تۆت چاستوتا ئايرىش كۆزنىكى 1.6 m / z ، ئېنىقلىق دەرىجىسى 30،000.AGC نىشانى 5 × 104 ۋە ئەڭ چوڭ كىرگۈزۈش ۋاقتى 150 ms.ھەرىكەتچان مۇستەسنا 30 سېكۇنت قىلىپ تەڭشەلدى. ئىمزا قويمىغان ئىئونلار ياكى 1+ ۋە> 7+ توك قاچىلانغانلار MS / MS ئۈچۈن رەت قىلىندى. ئىمزا قويمىغان ئىئونلار ياكى 1+ ۋە> 7+ توك قاچىلانغانلار MS / MS ئۈچۈن رەت قىلىندى. Неназначенные ионы или ионы с зарядом 1+ и> 7+ были отклонены для МС / МС. MS / MS ئۈچۈن 1+ ۋە> 7+ توك قاچىلانغان ئىمزاسىز ئىئون ياكى ئىئونلار رەت قىلىندى.未 指定 的 离子 或 电荷 为 1+ 和> 7+ 的 离子 被 拒绝 用于 MS / MS。未 指定 的 离子 或 电荷 为 1+ 和> 7+ 的 离子 被 拒绝 用于 MS / MS。 Неуказанные ионы или ионы с зарядами 1+ и> 7+ были отклонены для МС / МС. ئېنىق بولمىغان ئىئون ياكى ئىئونلار 1+ ۋە> 7+ ھەققى بىلەن MS / MS ئۈچۈن رەت قىلىندى.
خام سانلىق مەلۇمات MSFragger نى ئاساس قىلغان FragPipe ھېسابلاش سۇپىسى ئارقىلىق بىر تەرەپ قىلىنىدۇ.كەڭ كۆلەمدە بىر تەرەپلىمىلىك ۋە ماس كېلىدىغان ئامىنو كىسلاتاسى ئوچۇق ئىزدەش ھېسابلاش ئۇسۇلى ئارقىلىق ئالدىنئالا كەڭ كۆلەمدە بەرداشلىق بېرەلەيدىغان -150 دىن 500 Da غىچە ئېنىقلانغان.كېيىن ئۆزگەرتىلگەن پېپتىدلار PD دىكى ئاقسىلنىڭ +229.0964 ۋە +247.1069 Da بىلەن گىستودىن ئۆزگەرتىش ئارقىلىق ئېنىقلانغان (Proteome Discoverer 2.5 ، تېرمو).
بىرىكتۈرۈلگەن miniSOG گېنىنى مۇقىم ئىپادىلەيدىغان ھۈجەيرىلەر 6 سانتىمېتىرلىق قاچا-قۇچىلارغا قاچىلانغان.% 80 لىك تۇتاشتۇرۇشقا يەتكەندىن كېيىن ، ھۈجەيرىلەر HBSS (Gibco ، # 14025092) بىلەن بىر قېتىم يۇيۇلدى ، ئاندىن HBSS دىكى خىمىيىلىك تەكشۈرۈش ئەسۋابى بىلەن ° C 37 قا 1 سائەت چاپلاندى ۋە كۆك چىراغ بىلەن يورۇتۇلدى.ئۆي تېمپېراتۇرىسىدا 10W LED 20 مىنۇت.PDPL ، 0.5 mM ۋىتامىن C (MCE, # HY-B0166) ، 5 mM Trolox (MCE, # HY-101445) ، D2O (سىگما ، # 7789-20-0) قايسى خىل رېئاكسىيىلىك ئوكسىگېن تۈرىنىڭ بارلىقىنى ئېنىقلاش. ھۈجەيرىلەرگە 100 mM ماننىتول (ئېنېرگىيە خىمىيىلىك ، # 69-65-8) ، 100 mMM H2O2 ، 10 mM NaN3 تولۇقلىما سۈپىتىدە قوشۇلدى.سوغۇق PBS بىلەن يۇيۇلغاندىن كېيىن ، ھۈجەيرىلەر بىراك قىلىندى ، 1.5 مىللىمېتىر سېنترىفۇگ نەيچىسىدە يىغىۋېلىندى ۋە 200 مىللىمېتىرلىق PBS دا 1 مىنۇت ئاقسىل بىلەن چەكلەش دورىسى EDTA يوق (1 s ۋە 1 s ، ئامپلىتسىيە% 35).ھاسىل بولغان ئارىلاشما 15 سېلسىيە گرادۇس 15871 × گرامدا 10 سېلسىيە گرادۇستا 10 مىنۇت تۇرغۇزۇلدى ، خاسىيەتلىك ماددىنىڭ قويۇقلۇقى BCA ئاقسىل تەكشۈرۈش ئەسۋابى ئارقىلىق 1 mg / mL غا تەڭشەلدى.يۇقارقى لىزاتنىڭ تەخمىنەن 50 µl لىك 0.1 mM رودامىن ئازدى (ئالادىن ، T131368)چېكىش ئىنكاسىدىن كېيىن ، ئەۋرىشكەگە 250 مىللىمېتىر ئالدىن سوۋۇتۇلغان ئاتسېتون قوشۇش ئارقىلىق ئاتسېتون بىلەن ھۆل-يېغىن ئېلىپ بېرىلىپ ، -20 سېلسىيە گرادۇستا 20 مىنۇت ، 6010 × گرامدا 10 سېلسىيە گرادۇسلۇق 4 سېلسىيە گرادۇسلۇق ھاۋارايىدا.پېلەكنى يىغىپ ، 1x Laemmli نىڭ بۇففېرنىڭ 50 µl دە 95 سېلسىيە گرادۇستا 10 مىنۇت قاينىتىڭ.ئاندىن ئەۋرىشكەلەر SDS-PAGE ئۇزۇن گېلىدا ئانالىز قىلىنىپ ، Image Lab Touch يۇمشاق دېتالى بىلەن Bio-rad ChemiDoc MP Touch تەسۋىر ھاسىل قىلىش سىستېمىسى ئارقىلىق تەسۋىرلەنگەن.
قايتا ھاسىل بولغان miniSOG-6x ئۇنىڭ ئاقسىلىنى ئىپادىلەش ۋە ساپلاشتۇرۇش ئىلگىرى تەسۋىرلەنگەندەك ئېلىپ بېرىلدى.قىسقىچە قىلىپ ئېيتقاندا ، E. coli BL21 (DE3) ھۈجەيرىلىرى (TransGen, # CD701-02) pET21a-miniSOG-6xHis بىلەن ئۆزگەرتىلدى ۋە ئاقسىلنىڭ ئىپادىلىنىشى 0.5 mM IPTG (سانگون ، # A600168) بىلەن قوزغىتىلدى.ھۈجەيرە لىمزىسىدىن كېيىن ، Ni-NTA ئاگاروزا مونچاق (MCE ، 70666-نومۇر) ئارقىلىق ئاقسىل ساپلاشتۇرۇلۇپ ، PBS غا دىئالىز قىلىندى ۋە ° C80- دە ساقلاندى.
ۋىرۇسقا قارشى ئانتىتېلانى ئاساس قىلغان ئانتىتېلانى ئاساس قىلىش ئۈچۈن ، PBS دىكى 100 mMM ساپلاشتۇرۇلغان miniSOG ، 1 mM تەكشۈرۈش ئەسۋابى 3 ۋە 1 mgg ماركىغا قارشى چاشقان يەككە يەككە ئانتىتېلا (TransGen, # HT501-01) نى ئارىلاشتۇرۇڭ ، ئومۇمىي ئىنكاس مىقدارى 50 مىللىمېتىر..رېئاكسىيە ئارىلاشمىسى ئۆي تېمپېراتۇرىسىدا 0 ، 2 ، 5 ، 10 ۋە 20 مىنۇتلۇق كۆك LED چىرىغى بىلەن نۇرلانغان.بۇ ئارىلاشما 0.1 mM بىئوتىن- PEG3-azide (ئالادىن ، # B122225) ، 1 mM TCEP ، 0.1 mM TBTA لەگلەك ۋە 1 mM CuSO4 بىلەن ئۆينىڭ تېمپېراتۇرىسىدا 1 سائەت يۇقىرى تېمپېراتۇرىدا تەۋرىگەن.ئۇششاق-چۈششەك ئىنكاستىن كېيىن ، 4x Laemmli نىڭ بۇففېرنى بىۋاسىتە ئارىلاشتۇرۇپ ، 95 سېلسىيە گرادۇستا 10 مىنۇت قاينىتىڭ.ئەۋرىشكەلەر SDS-PAGE گېلىدا ئانالىز قىلىنغان ۋە streptavidin-HRP بىلەن غەربنىڭ پارچىلىنىشى ئارقىلىق ئانالىز قىلىنغان (1: 1000 ، Solarbio ، # SE068).
C تېرمىنالىنىڭ ئارىلىشىشى (LHDALDAK-CONH2) بىلەن گىستودىن بار بىرىكمە بىرىكمە پېپتىد يېقىن ئەتراپتىكى پېپتىدنى ئاساس قىلغان ۋىرۇس بەلگىسىنى تەھلىل قىلىشقا ئىشلىتىلگەن.بۇ تەكشۈرۈشتە ، 100 mMM ساپلاشتۇرۇلغان miniSOG ، 10 mM تەكشۈرۈش ئەسۋابى 3 ۋە 2 mg / ml بىرىكمە پېپتىد PBS دا ئارىلاشتۇرۇلدى ، ئومۇمىي ئىنكاس مىقدارى 50 مىللىمېتىر.رېئاكسىيە ئارىلاشمىسى ئۆي تېمپېراتۇرىسىدا 1 سائەت كۆك LED چىرىغى بىلەن نۇرلاندى.بىر مىكرو ئەۋرىشكە LC-MS سىستېمىسى ئارقىلىق ئانالىز قىلىنغان (سۇ ، SYNAPT XS Ions ھەرىكەتچانلىقى MassLynx سپېكترى ئانالىز يۇمشاق دېتالى بىلەن ئۇچۇش ۋاقتى ماسسىسى سپېكترى).
MiniSOG بىرىكتۈرۈش گېنىنى مۇقىم ئىپادىلەيدىغان HEK293T ھۈجەيرىلىرى ئوخشىمىغان ئورگانىك يەرلىكلەشتۈرۈش (Mito, ER, Nucleus) ۋە پاركىن-miniSOG ۋە BRD4-miniSOG لىنىيىسى ئۈچۈن 15 سانتىمېتىرلىق تاماقلارغا 10 سانتىمېتىرلىق تاماققا تېرىلدى.% 90 لىك تۇتاشتۇرۇشقا يەتكەندىن كېيىن ، ھۈجەيرىلەر HBSS بىلەن بىر قېتىم يۇيۇلدى ، ئاندىن HBSS دىكى 3-تەكشۈرۈش ئەسۋابى بىلەن ° C 37 قا 1 سائەت سىڭدۈرۈلۈپ ، ئۆي تېمپېراتۇرىسىدا 10 W كۆك رەڭلىك LED يورۇتۇلدى.پاركىننىڭ ئالاقىسىز بەلگىسى ئۈچۈن ، 10 µM پروتون كاربونېل سىئانىد توشۇغۇچى m-chlorophenylhydrazone CCCP (Solarbio, # C6700) HBSS دىكى 3-نومۇرلۇق تەكشۈرۈش ئەسۋابى 37 سېلسىيە گرادۇستا 1 سائەت قوشۇلدى.ھۈجەيرە لىمزىسى ، چېكىش خىمىيىسى ، كېمەيتىش ۋە ئىشقارلاش باسقۇچلىرى يۇقىرىدا بايان قىلىنغان بىلەن ئوخشاش بولۇپ ، بۇنىڭدىن باشقا ، 2 مىللىگىرام لىزات قوشۇلغاندىن كېيىن ، بىئوتىن PEG3 azide فوتوگرافىكلاشتۇرغىلى بولىدىغان بىئوتىن ئازدىنىڭ ئورنىغا چېكىش رېئاكسىيەسىدە ئىشلىتىلگەن.بېيىغاندىن كېيىن ، مونچاق 5 مىللىلېتىر PBS بىلەن% 0.2 SDS ، 3 قېتىم 5 مىللىلېتىر PBS بىلەن 1 M ئۇرېيە ، 3 قېتىم 5 مىللىلېتىر PBS بىلەن 3 قېتىم يۇيۇلدى.ئۇنىڭدىن كېيىن ، 300 µl 25 mM ABC غا 2 µg تىرىپسىن قوشۇلدى ، تەركىبىدە 1 M ئۇرېيە بار بولۇپ ، بىر كېچىدىلا 37 سېلسىيە گرادۇسلۇق ئاقسىلنى تازىلايدۇ.رېئاكسىيە كىسلاتا قوشۇش ئارقىلىق pH 2-3 گە يەتكۈچە توختىتىلدى.مونچاقتا تىرىپسىنلانغاندىن كېيىن ، پېپتىد ئېرىتمىسى SOLAµ HRP تۈۋرۈكى (Thermo, # 60209-001) ئارقىلىق تۇزسىزلاندۇرۇلۇپ ، Speedvac ۋاكۇئۇم قويۇقلۇقىدا قۇرۇتىلدى.پېپتىدلار% 0.1 لىك فورمات كىسلاتادا قايتا ئېرىپ ، 500 ng پېپتىد يۇقىرىدا بايان قىلىنغان nano-ESI مەنبەسى بىلەن ئوربىتاپ Fusion Lumos Tribrid ئاممىۋى سپېكترى ئارقىلىق ئانالىز قىلىنغان.پېپتىدلار سودا RP-HPLC ئالدىنئالا (75 mm x 2 cm) (تېرمو ، 164946 نومۇر) ۋە ئانالىز RP-HPLC تۈۋرۈكى (75 mm x 25 cm) (تېرمو ، 164941) ئايرىلدى ، ھەر ئىككىلىسى 2 مىللىمېتىر.60 مىنۇتتا تەدرىجىي% 8 تىن% 35 كىچە ACN ، ئاندىن 6 مىنۇتتا سىزىقلىق ھالدا% 98 لىك B غا ئۆرلەپ ، مىنۇتىغا 300 Nl / min.MS سپېكترى (350-1500 m / z) ئېنىقلىق دەرىجىسى 60،000 ، AGC 4 × 105 ، ئەڭ چوڭ كىرگۈزۈش ۋاقتى 50 ms.تاللانغان ئىئونلار HCD تەرىپىدىن 3 s دەۋرىيلىكىدە تەرتىپلىك ھالدا پارچىلىنىپ ، نورمال سوقۇلۇش ئېنېرگىيىسى% 30 ، تۆت چاسا ئايرىلىش كۆزنىكى 1.6 m / z ، ئېنىقلىق دەرىجىسى 15000. of 22 ms were used.ھەرىكەتچان چىقىرىۋېتىش 45 سېكۇنت قىلىپ تەڭشەلدى. ئىمزا قويمىغان ئىئونلار ياكى 1+ ۋە> 7+ توك قاچىلانغانلار MS / MS ئۈچۈن رەت قىلىندى. ئىمزا قويمىغان ئىئونلار ياكى 1+ ۋە> 7+ توك قاچىلانغانلار MS / MS ئۈچۈن رەت قىلىندى. Неназначенные ионы или ионы с зарядом 1+ и> 7+ были отклонены для МС / МС. MS / MS ئۈچۈن 1+ ۋە> 7+ توك قاچىلانغان ئىمزاسىز ئىئون ياكى ئىئونلار رەت قىلىندى.未 指定 的 离子 或 电荷 为 1+ 和> 7+ 的 离子 被 拒绝 用于 MS / MS。未 指定 的 离子 或 电荷 为 1+ 和> 7+ 的 离子 被 拒绝 用于 MS / MS。 Неуказанные ионы или ионы с зарядами 1+ и> 7+ были отклонены для МС / МС. ئېنىق بولمىغان ئىئون ياكى ئىئونلار 1+ ۋە> 7+ ھەققى بىلەن MS / MS ئۈچۈن رەت قىلىندى.
NeutrAvidin مونچاقلىرىنى بېيىتىشقىچە بولغان ئەۋرىشكە تەييارلاش باسقۇچلىرى يۇقىرىدا بايان قىلىنغان LC-MS / MS تەھلىلى بىلەن ئوخشاش.يۈك بېسىشنى كونترول قىلىش ئۈچۈن تەخمىنەن 50 mgg لىك لىزا ئىشلىتىلىدۇ ، چېكىش ئىنكاسىدا 2 مىللىگىرام لىمات ئىشلىتىلگەن.نېيتراۋىدىن بىلەن بېيىغاندىن كېيىن يۇيۇلغاندىن كېيىن ، باغلانغان ئاقسىللار لامملىنىڭ بۇففېردىن 50 مىللىمېتىر ئاگاروزا رېشاتكىسىغا قوشۇلۇپ ، 95 سېلسىيە گرادۇستا 5 مىنۇت قاينىتىپ چىقىرىۋېتىلدى.كونترول يۈك كىرگۈزۈش ۋە مونچاق موللاشتۇرۇلغان ئەۋرىشكە SDS-PAGE تەرىپىدىن ئانالىز قىلىنىپ ، غەربنىڭ ئۆلچەملىك blot ئۇسۇلى ئارقىلىق PVDF پەردىسىگە (Millipore, # ISEQ00010) يۆتكەلدى.پەردىلەر TBS دىكى% 5 لىك ياغسىز سۈت (سانگون ، # A600669) بىلەن توسۇلۇپ ،% 0.1 ئارىلىقىدا 20% (TBST) بار بولۇپ ، دەسلەپكى ۋە ئىككىلەمچى ئانتىتېلا بىلەن تەرتىپكە سېلىنىدۇ.دەسلەپكى ئانتىتېلا TBST دىكى% 5 ياغسىز سۈتتە 1: 1000 سۇيۇلدۇرۇلدى ۋە بىر كېچە ° C 4 قا يوشۇرۇندى.ئىككىلەمچى ئانتىتېلا 1: 5000 نىسبەتتە ئىشلىتىلگەن بولۇپ ، ئۆي تېمپېراتۇرىسىدا 1 سائەت سىڭدۈرۈلگەن.بۇ پەردىلەر Chemidoc MP تەسۋىر ھاسىل قىلىش سىستېمىسى ئارقىلىق خىمىيىلىك ماددىلار ئارقىلىق تەسۋىرلەنگەن.رەسىمدىكى بارلىق ئۈزۈلمىگەن سىكانېرلاش سايمانلىرى خام ماتېرىيال سۈپىتىدە كۆرسىتىلدى.
بۇ تەتقىقاتتا ئىشلىتىلگەن دەسلەپكى ئانتىتېلا توشقاننىڭ SFPQ غا قارشى يەككە ئانتىتېلا (CST ، 71992-نومۇر) ، توشقاننىڭ FUS غا قارشى يەككە ئانتىتېلا (CST ، 67840-نومۇر) ، توشقاننىڭ NSUN2 گە قارشى كۆپ قۇتۇپلۇق ئانتىتېلا (Proteintech ، 20854-1- نومۇرلۇق). AP. -CDK2 يەككە ئانتىتېلا (ABclonal, # A0094) ، توشقاننىڭ يەككە ئانتىتېلاسى CTBP1 (ABclonal, # A11600) ، توشقان كۆپ قۇتۇپلۇق ئانتىتېلا DUT (ABclonal, # A2901) ، توشقاننىڭ كۆپ قۇتۇپلۇق ئانتىتېلاسى PSMC4 (ABclonal, # A2505) DNAJB1 كۆپ قۇتۇپلۇق ئانتىتېلا (ABclonal, # A5504).بۇ ئانتىتېلالار TBST دىكى% 5 ياغسىز سۈتتە 1: 1000 سۇيۇلدۇرۇشتا ئىشلىتىلگەن.بۇ تەتقىقاتتا ئىشلىتىلگەن ئىككىلەمچى ئانتىتېلا توشقانغا قارشى IgG (TransGen, # HS101-01) ، چاشقانغا قارشى IgG (TransGen, # HS201-01) نى 1: 5000 سۇيۇلدۇرۇشتا ئۆز ئىچىگە ئالىدۇ.
BRD4 نىڭ SFPQ بىلەن ئۆز-ئارا تەسىر كۆرسىتىدىغان ياكى ئۇچرىمايدىغانلىقىنى تېخىمۇ ئىلگىرىلىگەن ھالدا تەكشۈرۈش ئۈچۈن ، HEK293T ۋە BRD4-miniSOG ھۈجەيرىسىنىڭ ھەددىدىن زىيادە بېسىم قىلىدىغان HEK293T ھۈجەيرىسىنىڭ 10 سانتىمېتىرلىق قاچا-قۇچىلارغا قاچىلانغانلىقى ئېنىقلاندى.ھۈجەيرىلەر سوغۇق PBS بىلەن يۇيۇلۇپ ، 1 مىللىلېتىر پىئېرسې IP لىزلىق بۇففېر (تېرمو فىشېر ، # 87787) دا EDTA ھەقسىز ئاقسىلنى كونترول قىلغۇچى بىلەن 30 سېلسىيە گرادۇستا 30 مىنۇت تۇرغۇزۇلدى.شۇنىڭدىن كېيىن ، لەيلىمە ماددىلار 1.5 مىللىلىتىرلىق سېفىرلىق تۇرۇبىلارغا يىغىۋېلىنىپ ، 15871 xg دە 10 مىنۇت 4 سېلسىيە گىرادۇسقىچە مەركەزلەشتۈرۈلدى.خاسىيەتلىك كېمە يىغىۋېلىنىپ 5 سېلسىيە گرادۇسلۇق 5 µg لىق V5 گە قارشى چاشقاننىڭ يەككە ئانتىتېلاسى (CST ، # 80076) بىلەن ° C4 قا چىقتى.تەخمىنەن 50 µl ئاقسىل A / G ماگنىتلىق مونچاق (MCE, # HY-K0202) نى PBS بىلەن ئىككى قېتىم يۇيۇڭ.ئاندىن ھۈجەيرە لىماتلىرى ماگنىتلىق مونچاق بىلەن 4 سېلسىيە گرادۇستا 4 سائەت تۆۋەندىن يۇقىرىغا ئايلىنىدۇ.ئاندىن مونچاقنى 1 مىللىلېتىر PBST بۇففېر بىلەن تۆت قېتىم يۇيۇپ ، 95 سېلسىيە گرادۇستا 5 مىنۇت قاينىتىمىز.ئەۋرىشكەلەر SDS-PAGE گېلىدا ئانالىز قىلىنىپ ، ئۆلچەملىك غەرب blot ئۇسۇلى ئارقىلىق PVDF پەردىسىگە يۆتكەلدى.پەردىلەر TBST دىكى% 5 ياغسىز سۈتتە توسۇلۇپ قېلىپ ، دەسلەپكى ۋە ئىككىلەمچى ئانتىتېلا بىلەن تەرتىپكە سېلىنىدۇ.دەسلەپكى ئانتىتېلا توشقاننىڭ SFPQ غا قارشى يەككە ئانتىتېلاسى (CST, # 71992) TBST دىكى% 5 ياغسىز سۈتتە 1: 1000 نىسبەتتە ئىشلىتىلگەن ۋە بىر كېچە ° C 4 قا چىققان.توشقانغا قارشى IgG 1: 5000 نىسبەتتە ئىشلىتىلگەن بولۇپ ، ئۆي تېمپېراتۇرىسىدا 1 سائەت سىڭدۈرۈلگەن.بۇ پەردىلەر Chemidoc MP تەسۋىر ھاسىل قىلىش سىستېمىسى ئارقىلىق خىمىيىلىك ماددىلار ئارقىلىق تەسۋىرلەنگەن.
Solvent Accessible Surface Area (SASA) تەھلىلى ئۈچۈن ئىشلىتىلگەن بارلىق قۇرۇلمىلار ئاقسىل سانلىق مەلۇمات بانكىسى (PDB) 52 ياكى AlphaFold ئاقسىل قۇرۇلمىسى سانلىق مەلۇمات ئامبىرىدىن ئېلىندى.مۇتلەق SASA FreeSASA پروگراممىسى ئارقىلىق ھەر بىر قالدۇق ئۈچۈن ھېسابلىنىدۇ.ھەر بىر قۇرۇلمىنىڭ ئوتتۇرىچە SASA غا ئېرىشىش ئۈچۈن پەقەت تولۇق ۋە ئېنىق بولمىغان SASA سانلىق مەلۇماتلىرى بار.ھەر بىر گىستېننىڭ نىسپىي ئېرىتىشچانلىقى (RSA) مۇتلەق SASA قىممىتىنى ئېرىتكۈچى ئېرىشەلەيدىغان تەجرىبە ئەڭ چوڭ قالدۇق يەر يۈزىگە بۆلۈش ئارقىلىق ھېسابلىنىدۇ.ئەگەر بارلىق RID نىڭ ئوتتۇرىچە قىممىتى% 20 دىن تۆۋەن بولسا ، بارلىق ئاشكارىلانغان ئۇچۇرلار يوشۇرۇن دەپ ئايرىلىدۇ.
DDA ھالىتىگە ئېرىشكەن خام ھۆججەتلەر ئورتاق بۇلغىمىلارنى ئۆز ئىچىگە ئالغان مۇناسىپ شىۋىتسارىيە پروت تەكشۈرۈلگەن ئاقسىل سانلىق مەلۇمات ئامبىرىدا Proteome Discoverer (v2.5) ياكى MSfragger (Fragpipe v15.0) ئارقىلىق ئىزدەلدى.پېپتىدلار يوقاپ كەتكەن ئىككى تازىلاش ئورنى بار تولۇق تىرىپسىننى تەلەپ قىلدى ، كاربامويل مېتىللاشتۇرۇش مۇقىم ئۆزگەرتىش ، مېتىئون ئوكسىدلىنىش بولسا ھەرىكەتچان ئۆزگەرتىش.ئالدى ۋە پارچە ئېغىرلىقىغا چىدامچانلىقى ئايرىم-ئايرىم ھالدا 10 ppm ۋە 0.02 Da (MS2 Orbitrap) قىلىپ بېكىتىلدى. بۇلغانما ماددىلار چىقىرىۋېتىلدى ، ئاقسىل سۈزۈلۈپ ، <1% يالغان بايقاش نىسبىتىگە ئېرىشتى. بۇلغانما ماددىلار چىقىرىۋېتىلدى ، ئاقسىل سۈزۈلۈپ ، <1% يالغان بايقاش نىسبىتىگە ئېرىشتى. Попадания загрязняющих веществ были удалены, а белki отфиль чвваня, ч чы получить коэффентент ложного обнаружения <1%. بۇلغانما ماددىلار چىقىرىۋېتىلىپ ، ئاقسىل سۈزۈلۈپ ، يالغان بايقاش نىسبىتى% 1.去除 污染物 命中 ， 过滤 蛋白质 以 获得 <1% 的 错误 发现 率。 <1% 的 错误 发现 率。 Попадания загрязняющих веществ были удалены, а белki отфиль кивя для достижения оровня ложных обнаружений <1%. بۇلغانما زەربە چىقىرىۋېتىلىپ ، ئاقسىل سۈزۈلۈپ ، ساختا مۇسبەت نىسبىتى% 1 كە يەتتى.بەلگە ئىشلەتمەي مىقدارلاشتۇرۇپ تەھلىل قىلىش ئۈچۈن ، ئۈچ خىل بىئولوگىيىلىك تەكرارلاشتىن نورمال ئاقسىل بار.ئاقسىل تارماق ھۈجەيرىسىنى يەرلىكلەشتۈرۈش ئانالىزى DAVID Bioinformatics Resources ، MitoCarta 3.0 ۋە Alice Ting گۇرۇپپىسى تۈزگەن ۋە ئېلان قىلغان سانلىق مەلۇمات ئامبىرىدىكى گېن ئونتولوگىيەسى (GO) ئانالىزىدىن پايدىلىنىپ ئېلىپ بېرىلدى.يانار تاغ خەرىتىسى پېرسېدىن ئېلىنغان (v1.6.15.0). ئاقسىلنىڭ مول قاتلىنىش ئۆزگىرىشى ئىككى تەرەپلىك T سىناقتىن پايدىلىنىپ ستاتىستىكىلىق ئەھمىيەتكە ئىگە بولۇپ ، ئاقسىلنىڭ سوقۇلۇشى مول ئۆزگىرىش> 2 (باشقىچە دېيىلمىگەن بولسا) ۋە p قىممىتى <0.05 بىلەن ئېنىقلاندى. ئاقسىلنىڭ مول قاتلىنىش ئۆزگىرىشى ئىككى تەرەپلىك T سىناقتىن پايدىلىنىپ ستاتىستىكىلىق ئەھمىيەتكە ئىگە بولۇپ ، ئاقسىلنىڭ سوقۇلۇشى مول ئۆزگىرىش> 2 (باشقىچە دېيىلمىگەن بولسا) ۋە p قىممىتى <0.05 بىلەن ئېنىقلاندى. ئىزمەنения кратности содержания белка были проверены на статистическую значимость с использованием дву меонненего t-критерия, и совпадения белков были идентифицирова с изменением сдержани> 2 ئاقسىلنىڭ قاتلىنىش ئۆزگىرىشى ئىككى قۇيرۇقلۇق T سىناقتىن پايدىلىنىپ ستاتىستىكىلىق ئەھمىيەتكە ئىگە بولۇپ ، ئاقسىلنىڭ ماسلىشىشى مەزمۇن ئۆزگىرىشى> 2 (باشقىچە ئەسكەرتىلمىگەن ئەھۋال ئاستىدا) ۋە ap قىممىتى <0.05.使用 双边 t 检验 测试 蛋白质 丰 度 倍数 变化 0.05 变化 变化 2 2 2> 2 （使用 双边 t 检验 测试 蛋白质 倍数 变化 的 统计 变化 变化 2 2 2 2> 2 （ Статистическую значимость кратных изменений содержanya белка проверяли с использованием дву зононнего t-критерия, а совпадения белков определяли для изменений содержnya> 2 (если не ука пао зое). ئاقسىل تەركىبىدىكى قاتلىنىش ئۆزگىرىشىنىڭ ستاتىستىكىلىق ئەھمىيىتى ئىككى قۇيرۇقلۇق T سىناقتىن پايدىلىنىپ سىناق قىلىنغان ، مەزمۇن ئۆزگىرىشى> 2 (باشقىچە كۆرسىتىلمىگەن بولسا) ۋە p قىممىتى <0.05.ئاقسىلنىڭ ئۆز-ئارا تەسىر ئانالىزى String ساندانى بىلەن بىللە GO ئانالىزىدىن پايدىلىنىپ ئېلىپ بېرىلدى.
مۇشۇنىڭغا ئوخشاش نەتىجىلەر بىلەن ئۈچ خىل بىئولوگىيىلىك كۆپەيتىش ئېلىپ بېرىلدى.ستاتىستىكىلىق ئانالىز GraphPad Prism (GraphPad يۇمشاق دېتالى) بىلەن ئېلىپ بېرىلىپ ، پېرسې (v1.6.15.0) بىلەن يانار تاغ پىلانلىرى بارلىققا كەلگەن.ئىككى گۇرۇپپىنى سېلىشتۇرۇش ئۈچۈن ، p- قىممىتى ئىككى قۇيرۇقلۇق ئوقۇغۇچىلارنىڭ T سىنىقىدىن پايدىلىنىپ بېكىتىلدى.تەجرىبە گۇرۇپپىسىدا كەم دېگەندە ئىككى قېتىم ئېنىقلانغان يەككە ئاقسىللا يانار تاغ پىلانىغا كىرگۈزۈلگەن بولۇپ ، كونترول گۇرۇپپىسىدىكى مۇناسىپ يوقاپ كەتكەن قىممەتلەر نورمال تەقسىماتتىن پېرسې بىلەن ئالماشتۇرۇلغان ، شۇڭا p قىممىتى ھېسابلانغان.خاتالىق بالدىقى ئوتتۇرىچە ± ئۆلچەملىك ياتلىشىشنى كۆرسىتىدۇ.ستاتىستىكىلىق ئانالىزنىڭ ئاقسىل ئانالىزىدا ، كەم دېگەندە ئىككى خىل بىئولوگىيىلىك كۆپەيتىشتە پەيدا بولغان ئاقسىلنىڭ موللىقى ساقلاپ قېلىندى.ئەۋرىشكە كۆلىمىنى ئالدىن بېكىتىش ئۈچۈن ستاتىستىكىلىق ئۇسۇل قوللىنىلمىدى.تەجرىبە تاسادىپىي ئەمەس.تەتقىقاتچىلار تەجرىبە ۋە نەتىجىنى باھالاش جەريانىدا ۋەزىپىلەرنى كۆرمەيتتى.
تەتقىقات لايىھىسىگە مۇناسىۋەتلىك تېخىمۇ كۆپ ئۇچۇرلارنى بۇ ماقالىگە باغلانغان تەبىئەت تەتقىقات دوكلاتىنىڭ قىسقىچە مەزمۇنىدىن كۆرۈڭ.
بۇ تەتقىقاتتا ئېرىشكەن ئاممىۋى سپېكترى سانلىق مەلۇمات سانلىق مەلۇمات سانلىق مەلۇمات PXD034811 (PDPL-MS سانلىق مەلۇمات ئامبىرى) دىكى iProX57 ھەمكارلىق ئامبىرى ئارقىلىق ProteomeXchange بىرلەشمە گەۋدىسىگە يوللاندى.خام سانلىق مەلۇمات خام ماتېرىيال ھۆججىتى شەكلىدە تەمىنلەنگەن.بۇ ماقالە ئەسلى سانلىق مەلۇمات بىلەن تەمىنلەيدۇ.
گىڭراس ، AC ، ئابى شىنزو ، KT & Raught, B. ئەتراپنى تونۇش: يېقىنچىلىققا تايىنىدىغان بىئوتىننى ئىشلىتىپ ئاقسىل مۇرەككەپلىكى ۋە خەرىتە ئورگانىكلىرىنى خاراكتېرلەندۈرۈش. گىڭراس ، AC ، ئابى شىنزو ، KT & Raught, B. ئەتراپنى تونۇش: يېقىنچىلىققا تايىنىدىغان بىئوتىننى ئىشلىتىپ ئاقسىل مۇرەككەپلىكى ۋە خەرىتە ئورگانىكلىرىنى خاراكتېرلەندۈرۈش.گىڭراس ، AS ، ئابى شىنزو ، KT ۋە Raut ، B. ئەتراپقا پىششىق بولۇش: يېقىنچىلىققا تايىنىدىغان بىئوتىننى ئىشلىتىپ ئاقسىل مۇرەككەپلىكى ۋە خەرىتە ئورگانىكلىرىنى خاراكتېرلەندۈرۈش. Gingras, AC, Abe, KT & Raught, B. 了解 邻里 ： 使用 邻近 依赖性 生物 化 化 表征 表征 复合。。。。 Gingras, AC, Abe, KT & Raught, B. ئەتراپنى چۈشىنىش: ئەتراپنىڭ بىئولوگىيىلىك تۇرمۇشقا تايىنىشچانلىقىنى ئىشلىتىڭ.Gingras, AS, Abe, KT and Raut, B. يېقىنلىقنى چۈشىنىش: ئاقسىلنىڭ مۇرەككەپلىكى ۋە ئورگانىزىملارنىڭ يېقىنلىشىشىغا تايىنىدىغان بىئوتىننى ئىشلىتىش ئارقىلىق خەرىتە سىزىش.نۆۋەتتىكى.مېنىڭ قارىشىم.خىمىيىلىك.بىئولوگىيە 48 ، 44–54 (2019).
Geri, JB et al.Dexter ئېنېرگىيىسىنى ئىممۇنىتېت ھۈجەيرىسىگە يۆتكەش ئارقىلىق مىكرو مۇھىتنى سىزىش.ئىلىم 367 ، 1091–1097 (2020).
Hertling, EL et al.ئىككى خىل ئاقسىللىق كۆلەمدىكى تورلار ئىنسانلارنىڭ ئۆز-ئارا تەسىرلىشىشىنى ھۈجەيرىلەرگە خاس ئۆزگەرتىشنى بايقايدۇ.184 ، 3022–3040.e3028 (2021).